突破传统周期！人源血管类器官实现 5 天速成！

期刊：CellStemCell

期刊影响因子：IF=44.8（CellStemCell2024）

文献核心：建立两套（多西环素诱导、modRNA无基因组整合）从人iPSC快速制备血管类器官（VO）的完整技术体系，仅需5天获得同时包含内皮（iEC）、壁细胞（iMC）的三维功能性血管类器官，可实现体外成熟，体内可定植、形成灌注血管，在后肢缺血、胰岛移植动物模型具备治疗潜力。

1.细胞水平：流式、qPCR、BulkRNA‑seq对比2D与VO来源iEC/iMC转录组成熟度；

2.类器官组织水平：全组织免疫荧光、CUBIC透明共聚焦成像，观察血管网络、管腔、极性、细胞空间排布；

3.单细胞水平：scRNA‑seq解析细胞异质性；区分动脉内皮、血管生成内皮、平滑肌、周细胞、成纤维细胞、祖细胞；解析TF激活时长命运调控；

4.体外功能：出芽实验、管形成实验、炎症刺激白细胞黏附分子表达；

5.体内组织移植水平：NSG小鼠肾被膜移植，生物发光、组织学、UEA‑1灌注验证人源血管定植与吻合；

6.疾病模型功能疗效水平：糖尿病裸鼠后肢缺血血流恢复；糖尿病NSG小鼠胰岛移植血糖纠正，证明再生医学应用潜力。

两套方案：多西环素Dox诱导系统；modRNA无基因组整合系统

模块1：iPSC诱导为中胚层祖细胞MePC

操作周期/时间节点：48h（2天）

核心试剂与关键材料：iPSC（BJ273），mTeSRPlus，Y27632，CHIR99021（6 μM），AdvancedDMEM/F‑12基础培养基，GlutaMax，L‑抗坏血酸磷酸酯，青霉素‑链霉素

核心操作步骤

• iPSC消化为单细胞，接种于Matrigel包被6孔板，mTeSR+5 μMY27632；

• 细胞汇合30‑40%，更换S1培养基（基础培养基+6 μMCHIR99021）；

• 持续培养48h，获得MePC细胞。

注意事项：汇合度严格控制30‑40%；CHIR浓度固定6 μM，直接影响中胚层诱导效率，浓度异常会导致后续类器官生成失败。

模块2‑A：Dox诱导型血管类器官VO制备（第0‑5天）

操作周期/时间节点：MePC之后再加3天诱导，总流程5天

核心试剂材料：Dox‑ETV2iPSC、Dox‑NKX3.1iPSC来源MePC；S2培养基：基础培养基+0.5 μg/mL多西环素、EGF(10 ng/mL)、FGF‑2(50 ng/mL)、VEGF(50 ng/mL)；低粘附6孔悬浮板；轨道摇床。

核心操作步骤：

• 分别消化Dox‑ETV2‑MePC、Dox‑NKX3.1‑MePC，细胞数量1:1等比例混合（各2 × 10⁶细胞）；

• 接种低粘附悬浮板，加入S2培养基；

• 轨道摇床转速100 rpm，每日换液；Dox持续诱导3天；得到Day5VO，直径约250 μm。

注意事项：①严格1:1混合两种MePC；②摇床转速100rpm，转速过高聚团破碎，过低细胞沉降融合；③Dox浓度0.5 μg/mL，浓度改变会改变TF表达强度，影响iEC/iMC比例；④悬浮三维阶段不需要外源性Matrigel/胶原。

模块2‑B：modRNA无基因组整合VO制备（第0‑5天）

操作周期/时间节点：MePC后3天三维培养，总流程5天

核心试剂材料：野生型iPSC来源MePC；ETV2‑modRNA、NKX3.1‑modRNA；Neon电转试剂盒；S2培养基（不加Dox）；悬浮板，轨道摇床。

核心操作步骤

• MePC分成两份：一份电转1 μgETV2‑modRNA/2 × 10⁶细胞；另一份电转1 μgNKX3.1‑modRNA/2 × 10⁶细胞；

• 转染后两种细胞1:1混合；悬浮板接种，S2培养基，摇床100rpm，培养3天得到modRNA‑VO。

注意事项：modRNA表达瞬时（约24h），因此iEC比例（20‑30%）天然低于Dox‑VO（~50%），属于系统固有特征，不是操作失败；转染效率直接决定类器官质量，电转参数不可随意改动。

模块3：ECM包埋实现VO体外成熟得到mVO（Day5→Day10）

操作周期/时间节点：额外5天培养

核心试剂材料：I型胶原+Matrigel复合基质；StemPro‑34SFM，15%FBS，VEGF‑A(100 ng/mL)，FGF‑2(100 ng/mL)；12孔板。

核心操作步骤

• 先铺底层胶，37℃固化2h；收集Day5VO，重力沉降收集，洗涤；

• VO重悬于胶原‑Matrigel混合胶，铺在底层胶之上；37℃固化2h；

• 加入成熟完全培养基，每48h换液；培养5天，获得mVO，直径≈1 mm。

注意事项：VO密度控制，密度太高会发生类器官相互融合；对照组设置同等时长悬浮培养VO‑D10，区分“时间延长效应”与“ECM包埋成熟效应”；成熟驱动来自ECM，不是单纯延长培养时间。

模块4：细胞分选、分子与表型鉴定

关键材料：CD31磁珠分选试剂盒；qPCR、BulkRNA‑seq、10×scRNA‑seq；流式抗体；免疫荧光（全组织、CUBIC透明化）。

关键参数：VO解离使用TrypLE，37℃消化；scRNA‑seq过滤标准：基因200‑9000，线粒体<20%。

注意事项：全组织染色、CUBIC透明化步骤时间严格控制，透明化失败会造成共聚焦成像信号丢失。

模块5：体内动物移植实验

肾被膜移植/后肢缺血/胰岛共移植

关键参数：肾被膜移植每只小鼠移植1000个VO；后肢缺血模型每只注射1000个VO；胰岛移植每只搭配1500个VO；STZ糖尿病造模剂量裸鼠220 mg/kg。

必守操作红线：VO采用luciferase报告标记iEC用于活体生物发光追踪；灌注验证采用UEA‑1尾静脉注射，只有人内皮结合UEA‑1，用于区分人源/小鼠源血管；动物全部使用IACUC批准方案操作。

1.通过ETV2和NKX3.1激活生成血管类器官及其体内定植

(A)iPSC生成VO两步流程示意图；(B)Day5VO明场；(C)VO直径统计；(D)Day5iEC流式；(E)qPCR中胚层、内皮、壁细胞标志物时序变化；(F‑G)免疫荧光展示血管网络、早期管腔与细胞极性；(H‑K)NSG小鼠肾被膜移植，生物发光、H&E、免疫荧光、UEA‑1灌注，证明VO体内定植、形成与人宿主吻合的可灌注人源血管。

结论：双转录因子策略5天生成结构完整VO；移植体内可以实现血管定植与血液灌注。

2.VO来源iEC/iMC表型验证与成熟特征

(A)实验设计VO细胞与二维分化细胞对比；(B)PCA转录组相似性分析；(C)GO富集；(D‑E)差异基因火山图；

结论：三维VO共分化环境显著促进iEC、iMC转录水平成熟，壁细胞受共培养环境影响更大。

3.ECM包埋后VO进一步成熟

(A)ECM包埋mVO与单纯悬浮培养VO‑D10对照设计；(B)直径统计；(C‑E)全组织免疫荧光血管网络、平滑肌包绕、基底膜IV型胶原；(F‑I)qPCR泛内皮、动脉、静脉、壁细胞标志物对比mVO与Day5VO。

结论：ECM包埋（不是单纯时间延长）驱动VO进一步成熟，向内皮动脉化、壁细胞平滑肌化转变。

4.Dox‑VO和modRNA‑VO两种制备方案对比

(A)modRNA制备VO流程图；(B)类器官大小对比；(C)modRNA‑VOiEC流式；(D‑E)qPCR对比两套系统iEC/iMC标志物；(F)modRNA‑VO包埋成熟后血管网络免疫荧光。

结论：modRNA实现无基因组整合VO，但瞬时TF表达导致iEC比例下降；modRNA‑VO仍然可以ECM包埋实现成熟。

5.转录因子激活时长调控iEC细胞命运

(A)Dox1‑VO（1天诱导，短时TF激活）vsDox3‑VO（3天持续诱导）；(B)大小对比；(C)流式内皮亚群比例；(D)动‑静脉标志物qPCR；(E)免疫荧光SOX17动脉标记；(F)体外出芽实验，DAPTNotch抑制剂干预；(G‑L)肾被膜体内移植对比定植、血管密度、动静脉表型。

结论：短时间TF激活主要生成动脉样内皮；持续3天TF激活产生混合异质性内皮，包含血管生成/静脉样前体，体外出芽更强，体内移植血管整合效率更高。

6.scRNA‑seq揭示VO细胞异质性

(A)单细胞测序三组样本Dox1‑D5、Dox3‑D5、Dox3‑D12；(B‑K)UMAP、细胞簇标记点图、火山图、亚群计数统计；鉴定动脉内皮、血管生成内皮、增殖内皮；平滑肌、周细胞、成纤维细胞、壁祖细胞；拟时序RNA‑velocity证明动脉细胞起源于血管生成静脉样前体细胞。

结论：VO重现血管细胞谱系异质性；TF激活时程调控内皮亚群；延长培养促进动脉化、壁细胞成熟。

7.VO体内治疗潜力（疾病模型）

(A‑E)糖尿病裸鼠后肢缺血模型：移植VO、生物发光、免疫荧光人源血管、激光多普勒血流、肢体坏死评分；(F‑I)糖尿病NSG小鼠胰岛‑VO共移植模型，不同胰岛当量血糖曲线，移植物免疫荧光。

结论：VO移植促进缺血后血流恢复，减轻组织坏死；VO共移植显著提升胰岛移植功能，降低实现糖尿病逆转需要的胰岛细胞用量。

1.正交双转录因子ETV2/NKX3.1同步分别驱动内皮、壁细胞分化

解决旧方案：壁细胞自发产生，细胞组分不可控；化学诱导壁细胞成熟度低的缺陷；实现同一类器官中iEC、iMC可控共分化。

2. 5天快速生成基础VO，早期三维组装不依赖外源性ECM

解决旧方案：培养周期长达3周，早期必须外源性基质、难以规模化；依靠细胞内源沉积ECM，后期可按需加入基质实现进一步成熟。

3.提供两种技术版本（Dox诱导+modRNA无基因组整合），同时实现时序可控调控内皮动‑静脉命运；并且完成体内移植与疾病模型治疗验证

解决旧方案：多数血管类器官为体外建模工具，缺少无基因组整合版本、缺少体内治疗转化验证；转录因子激活时长可以人为调控动脉/血管生成型内皮比例。

参考文献：Rapid generation of functional vascular organoids via simultaneous transcription factor activation of endothelial and mural lineages