RNA提取：Trizol法 vs 柱提法怎么选？不同样本的取舍边界

在进行RNA提取实验时，要关注三个重要指标：起始样本量、样本处理难易程度，以及后续要检测哪一类RNA。 Trizol法得率通常较高，对高脂、高RNase组织和较大样本量适应性较好；硅胶膜柱法步骤短、批间一致性好，也更容易整合DNase处理。在实验中需要注意微量样本——RNA本身较少，再经过分相、转移和沉淀，很容易实际回收率低。

Trizol提取时最容易影响下游实验的是水相吸取过深、RNA沉淀丢失以及乙醇/酚残留。如果A260/230明显偏低，RT-qPCR、建库和部分酶促反应都可能受到抑制。

柱法的优势是流程稳定，但“柱法”并不代表所有RNA都能等比例回收。在研究miRNA、tRNA等小RNA时，要明确选择total RNA including small RNA或专门的miRNA提取体系。部分常规柱流程会把＜200 nt RNA作为单独组分处理。

图1丨Trizol 氯仿离心分层实拍

图2丨硅胶膜离心柱 RNA 提取标准流程图

如果是普通肝、肿瘤、脾脏等组织，两种方法都可以使用。如果样本量较大、希望获得较高总RNA得率时，Trizol比较合适；当样本数量多，需要统一操作并直接进行RT-qPCR或转录组时，柱法更方便。

脂肪、脑组织以及RNase活性较高的组织处理时，更强调快速、彻底失活RNase。酚/胍体系裂解能力强，常可用于这类较难处理的样本。在取材后立即液氮冻存、加入RNA稳定液，或直接进入含强变性剂的裂解体系，避免组织在室温放置过程中发生降解。

但无论Trizol还是柱法，组织量都不能无限增加，超过裂解液处理能力都会导致裂解不充分，增加DNA、蛋白和脂质污染。

常规培养细胞做RT-qPCR，柱法操作更简单，特别适合同一批需要处理几十个样本的实验。细胞裂解后直接上柱，洗涤、DNase处理和洗脱可以连续完成。

如果细胞量较大，后面还要做RNA-seq、Northern blot或需要较高RNA总量，也可以直接使用Trizol。

如果样本细胞数低时要注意实际回收率，几百到几千个细胞的RNA总量很低，Trizol虽然可以通过加入glycogen等carrier改善沉淀，但整个过程中需要分相、转移和沉淀，多一步操作就多一次损失机会。这类样本可以优先考虑micro/low-input柱、磁珠或专门的低输入RNA提取体系。

培养上清、血浆和血清中的游离RNA含量远低于细胞和组织，与普通组织Trizol流程不同。

酚/胍法需要使用适配液体样本的体系，例如TRIzol LS，不能只增加普通Trizol用量。也可以直接选择血清/血浆、cell-free RNA或miRNA专用试剂盒。

这类型样本在NanoDrop上出现测不到可靠浓度的可能性较高，当RNA量过低时，260 nm吸光值已经接近仪器检测下限，A260/280和A260/230会参考价值下降。此时可以使用RT-qPCR、数字PCR或适合低浓度样本的荧光定量方法，并加入外源RNA spike-in监控提取过程。血浆/血清cell-free RNA同样不可以只依赖分光光度法定量。

如果样本已经完成EV或外泌体分离，RNA提取时需要同时考虑RNA总量极低和RNA片段偏短两个问题。

这类样本优先选择明确支持EV RNA、miRNA或低输入total RNA的提取体系。

普通RNA柱如果不保留小RNA，可能直接改变最终检测到的RNA组成；单纯使用Trizol沉淀，则容易因为RNA量太低而出现肉眼不可见的RNA pellet和较大的操作损失。

如果后续研究miRNA或进行small RNA-seq，提取方法必须全批次统一，同时建议加入外源spike-in。EV RNA也不适合套用细胞总RNA的RIN判断标准，其RNA组成与完整细胞RNA不同。

常见EV分离方法并不能保证获得完全纯的“外泌体”，因此在正式研究中应记录EV分离方法、RNA提取方法及相关鉴定结果，避免把共同分离出的游离RNA直接解释成囊泡内部RNA。

1. 柱上DNase

RNA结合到柱膜后直接加入RNase-free DNase I消化，再继续洗涤和洗脱。

这种方式操作步骤少，DNase和反应液可以在后续洗涤中去除，适合常规细胞、组织和批量RT-qPCR样本。对于DNA含量特别高的组织或低丰度转录本检测，仍要确认残留DNA是否已经达到可接受水平。

2. 提取后DNase处理

先获得RNA，再单独进行DNase消化。优势是处理强度和时间更容易调整，适合Trizol提取后的RNA，或者已经发现明显DNA污染的样本。

缺点是DNase处理结束后通常还要进行纯化或失活，多一次操作就会增加RNA损失。微量RNA样本尤其要谨慎，不能为了去掉少量DNA，把原本就很少的RNA进一步损失掉。

RT-qPCR实验还应保留No-RT对照，并尽量使用跨外显子连接处或跨内含子的引物设计。DNA去除和引物设计是两层控制，不能相互替代。

1. 普通组织、大量培养细胞：Trizol和柱法均可，根据得率和批量需求选择。

2. 高脂、高RNase或较难裂解组织：优先考虑强裂解的酚/胍体系，再根据下游要求增加纯化。

3. 少量细胞、微量组织：优先low-input柱或磁珠体系。

4. 血浆、血清、培养上清：选择液体样本/cell-free RNA专用方案，不直接照搬细胞RNA提取。

5. EV/外泌体RNA、miRNA：选择明确保留small RNA的低输入体系，并固定提取方法和spike-in方案。