Cell Stem Cell｜comBO构建完整骨-造血复合微环境！

期刊名称：CellStemCell

发表时间：2026年3月5日

核心：建立一套hiPSC来源、可高通量制备、同时包含成骨龛+血管+淋系+髓系造血区室的人源骨髓复合类器官（comBO）；搭建多发性骨髓瘤嵌合类器官模型，并在模型中验证MIF炎症轴为骨髓瘤可靶向治疗靶点。

1.总技术路线逻辑

①以人诱导多能干细胞（hiPSC）为起始原料，在生理低氧环境下序贯施加细胞因子诱导分化，结合颗粒状微凝胶三维支架，一次性同步诱导出血管、成骨基质、淋系造血、髓系造血四大细胞区室；

②完成类器官形态、分子、功能鉴定后，植入患者原代骨髓瘤细胞构建嵌合疾病模型；

③通过单细胞转录组+细胞互作分析筛选关键通路，再利用药物干预+基因敲除完成靶点因果验证。

2.分阶段实验框架

阶段1：comBO类器官定向分化构建：hiPSC序贯中胚层诱导→造血+基质多谱系同步分化→颗粒状微凝胶三维包埋培养；核心任务：实现骨、血管、淋系、髓系多谱系同步发育。

阶段2：类器官质控与体系优化：对比颗粒微凝胶与传统块状水凝胶；核心任务：建立高通量、高重复性的规模化制备方案。

阶段3：体外功能学验证：连续传代造血潜能测试、T细胞体外成熟验证、动态血流血管发育实验；核心任务：证明comBO具备长期维持造血干细胞、支持淋巴细胞发育的生理功能。

阶段4：疾病嵌合模型构建：植入多发性骨髓瘤患者CD138+原代浆细胞，建立MM-comBO嵌合类器官；核心任务：复刻骨髓瘤骨髓微环境重塑、骨质破坏、炎症活化等病理表型。

阶段5：机制挖掘与靶点验证：单细胞转录组+CellChat细胞互作分析筛选MIF通路；使用小分子抑制剂+CRISPR基因敲除完成功能验证；核心任务：明确MIF是骨髓瘤炎症微环境的关键驱动因子。

模块1：comBO类器官诱导分化（核心构建环节）

1.操作周期与时间节点

中胚层诱导：0～20天，全程5%O₂生理低氧培养；

淋系定向诱导：第10天切换细胞因子；

造血+基质谱系成熟：第21天完成多谱系初步形成；

终末成熟：第21～35天转入20%常氧继续培养。

2.核心试剂与关键材料

细胞：KOLF2.1JhiPSC细胞系；

三维支架：颗粒状微凝胶（机械破碎块状水凝胶制备）；

关键细胞因子：髓系诱导因子、IL-7（淋系发育核心因子）；

培养板：96孔超低吸附培养板。

3.核心操作步骤

低氧（5%O₂）条件下对hiPSC进行为期20天的中胚层序贯诱导；

第10天关键切换：撤除髓系分化因子，加入IL-7启动淋系细胞发育；

制备颗粒微凝胶，与细胞聚集体充分混匀，分装至96孔板，离心压实微凝胶；

第21天完成初次谱系鉴定；第21～35天转为常氧培养，促进T/B淋巴细胞成熟、骨基质矿化。

4.注意事项：

前20天必须严格维持5%低氧，常氧培养会直接导致成骨龛发育失败、淋系细胞无法生成；

淋系诱导窗口期严格锁定在第10天，过早/过晚加入IL-7都会造成T/B祖细胞丰度大幅下降；

颗粒微凝胶必须离心压实，松散状态下无法形成管状血管网络；

全程不添加外源性血清，避免基质细胞谱系紊乱。

模块2：高通量颗粒微凝胶体系优化

1.核心操作要点

将整块水凝胶机械破碎为微米级颗粒，用量较传统块状包埋减少80%；

胞-微凝胶混合体系直接分装至96/384孔板，全程无需手动挑取、剥离类器官；

平行设置块状水凝胶对照组，保证细胞谱系组成无差异。

2.注意事项

禁止使用超声破碎微凝胶，超声会破坏水凝胶结构，丧失三维支撑能力，只能采用机械剪切破碎。

模块3：造血干细胞长期传代功能验证

操作周期：共计8周（3轮连续传代，每轮培养2周）

起始细胞：健康人原代CD34+细胞/mScarlet荧光标记comBO来源CD34+细胞；

接种密度：每枚类器官接种100个CD34+细胞；

培养条件：无外源生长因子的基础培养基；

传代流程：培养14天→解离类器官→分选CD34+细胞→接种至新的空白comBO，连续传代3次。

注意事项：传代全程严禁补充SCF、IL-6等造血细胞因子，否则无法证明类器官基质自身造血支持功能。

模块4：多发性骨髓瘤嵌合类器官（MM-comBO）建模

1.操作周期

细胞植入窗口：comBO分化第21天；

嵌合培养周期：14～28天。

2.分组干预方案

实验组：comBO植入CD138+骨髓瘤原代细胞（CellTraceViolet荧光标记）；

阳性对照：comBO植入健康供体CD34+细胞；

空白对照：未植入肿瘤细胞的空载comBO；

药物干预亚组：植入第5天加入MIF抑制剂ISO-1（低剂量7.5μM、高剂量15μM），每72小时给药一次；阳性药对照组：10nM硼替佐米。

3.检测指标与技术手段

细胞增殖：CellTraceViolet流式荧光稀释实验；

细胞表型：流式细胞术检测CD38、CD138、Ki67；

病理形态：H&E石蜡切片、共聚焦免疫荧光染色；

炎症因子：Luminex液相芯片检测TNF-α、IL1-RA、PDGF等；

转录组：单细胞RNA测序+Xenium空间转录组（患者骨髓活检样本）；

细胞互作：CellChat配体-受体互作分析。

模块5：MIF靶点因果验证

细胞模型：AMO-1骨髓瘤细胞，构建MIFCRISPR敲除克隆；

干预方案：将MIF敲除/野生型AMO-1细胞植入comBO，培养7天后收集上清；

检测指标：Luminex定量IL6、IL1RA、PDGF-AA炎症因子水平。

1.hiPSC来源comBO构建方案的建立与验证

结果：成功建立低氧双阶段诱导方案，第35天同步生成淋系、髓系、血管、成骨多谱系；单细胞转录组证实细胞转录谱与成人骨髓高度同源；谱系追踪证明HSC可双向分化为淋系与髓系细胞。

结论：comBO可在单种类器官内构建完整多龛骨髓微环境，细胞成熟度接近成体骨髓。

2.高通量颗粒状微凝胶法制备comBO的建立与验证

结果：颗粒微凝胶替代块状水凝胶后，细胞谱系组成、血管结构无丢失；体系兼容96孔板高通量培养，无需人工剥离类器官。

结论：颗粒微凝胶方案解决了传统培养难以规模化的技术瓶颈，保证模型重复性。

3.comBO来源细胞的功能验证

结果：原代CD34+细胞可连续传代3次、维持8周淋-髓造血潜能；comBO来源T祖细胞可在胸腺类器官中发育为成熟T细胞；动态血流可促进血管网络复杂化。

结论：comBO基质龛可长期维持造血干细胞干性，具备完整的造血支持生理功能。

4.comBO支持原代多发性骨髓瘤细胞植入

结果：3例患者CD138+浆细胞可在comBO内持续增殖，稳定维持浆细胞表型；单细胞测序重现骨髓瘤诱导的基质细胞丰度改变。

结论：comBO可作为全人源离体平台，支持原代肿瘤细胞长期培养，复刻肿瘤-微环境相互作用。

5.多发性骨髓瘤植入的comBO重现复杂疾病病理特征

结果：MM-comBO中MSC、骨谱系细胞炎症通路显著上调；脂肪细胞数量显著增多；中性粒细胞、巨噬细胞释放大量促炎因子，基质细胞发生癌相关成纤维细胞活化。

结论：嵌合类器官完整重现骨髓瘤骨髓炎症、脂质代谢紊乱、骨稳态失衡的病理表型。

6.细胞间相互作用分析揭示骨髓瘤微环境重塑机制与潜在治疗靶点

结果：CellChat分析筛选出MIF-(CD74+CD44)为骨髓瘤细胞与髓系免疫细胞间最核心互作通路；Xenium空间转录组证实患者骨髓中浆细胞是MIF信号主要来源；ISO-1药物抑制与MIF基因敲除均可显著降低炎症因子分泌，抑制肿瘤增殖且无明显骨髓毒性。

结论：浆细胞分泌的MIF是骨髓瘤炎症微环境的关键驱动因子，MIF抑制是低毒有效的潜在治疗策略。

1.多谱系同步分化方案（解决谱系单一缺陷）：采用5%生理低氧+双阶段细胞因子调控，在同一类器官内同时诱导出成骨基质、血管内皮、髓系细胞、T/B淋系祖细胞，打破旧模型只能支持髓系造血的局限。

2.颗粒状微凝胶三维支架（解决规模化难题）：将整块水凝胶机械破碎为微粒，替代传统块状包埋；无需人工剥离类器官，水凝胶用量减少80%，兼容96/384孔板高通量培养，大幅提升实验重复性。

3.无外源性细胞因子长期造血维持体系（解决干细胞体外失活问题）：comBO自身基质细胞可分泌造血支持因子，无需额外添加细胞因子即可支持CD34+造血干祖细胞连续3次传代、维持8周淋-髓双向分化潜能。

参考文献：comBO: A combined human bone and lympho myeloid bone marrow organoid for preclinical  modeling of hematopoietic disorders