蛋白互作不知道选哪个实验？一文搞懂Co-IP、Pull-down、SPR、FRET…原理及选择标准

研究两个蛋白有没有互作，能用的方法很多，但不同实验回答的问题并不一样。Co-IP看到两个蛋白一起被沉淀下来，不代表一定是直接结合；SPR能给出KD、结合和解离速率，却不能反映细胞内真实环境；FRET可以观察活细胞中的近距离变化，但对荧光标记、蛋白构象和仪器要求更高。

选实验前先确定：验证细胞内是否处于同一复合物、证明两个蛋白直接结合、测亲和力和动力学，还是观察活细胞中的动态互作。

Co-IP是蛋白互作研究中最常用的方法之一。利用针对bait蛋白的抗体将其从细胞或组织裂解液中沉淀下来，再通过Western blot检测prey蛋白是否一起被拉下。

它的优势是保留了较多细胞内蛋白复合物信息，适合验证已有互作假设，也能用于内源蛋白互作检测。

但Co-IP阳性只能说明两个蛋白存在于同一复合物中。A和B之间可能直接结合，也可能通过蛋白C连接。因此，如果后续要证明“直接物理结合”，还需要Pull-down、SPR等实验补充。

Co-IP还比较容易受裂解液、去垢剂、盐浓度和洗涤强度影响。互作较弱或持续时间很短时，裂解后复合物可能解离，最终出现阴性结果。

适合：内源互作验证、蛋白复合物研究、已有候选蛋白的互作确认。

Pull-down和Co-IP的操作逻辑相似，但捕获bait通常不是靠bait特异性抗体，而是利用GST、His等标签及相应亲和介质固定bait，再检测是否能捕获prey。

如果bait和prey都是纯化蛋白，体系中没有其他蛋白参与，此时Pull-down阳性可以较有力地支持两者存在直接结合。如果prey来源是细胞裂解液，仍然可能通过第三方蛋白间接连接。

Pull-down还很适合做结合区域分析。例如分别表达一个蛋白的全长和多个截短体，与另一蛋白进行Pull-down，可以进一步定位可能的结合结构域。

适合：直接互作验证、结合结构域定位、缺少合适Co-IP抗体时的互作研究。

SPR通常将一个分子固定在芯片表面，让另一个分子以不同浓度流过芯片，并实时记录结合和解离过程。它属于无标记、实时的分子互作分析方法。

SPR能够得到几个非常有用的参数：

kon：结合速率常数；

koff：解离速率常数；

KD：平衡解离常数，常用于表示亲和力。

KD越小，通常表示亲和力越高。但SPR的数据质量非常依赖蛋白纯度、固定方向、表面密度、缓冲体系和拟合模型。固定过密还可能产生再结合、传质限制或多价效应，造成亲和力偏差。

适合：蛋白-蛋白、蛋白-抗体、蛋白-小分子的直接结合验证，以及亲和力和动力学分析。

BLI与SPR的用途接近，同样可以实时、无标记地测量结合特异性、KD及动力学参数，在需要同时处理较多样本时比较方便。

FRET利用供体和受体荧光分子之间的能量转移判断两者是否足够接近。有效FRET通常发生在约1～10 nm尺度，因此很适合观察活细胞中蛋白接近、分离以及构象变化。

例如研究受体激活后蛋白A是否迅速靠近蛋白B，可以连续成像观察FRET信号随刺激时间变化，Co-IP和Pull-down实验很难做到这点。

但FRET对荧光蛋白位置、供受体方向、表达量和光谱串扰都比较敏感。没有FRET信号也不能直接判定“不互作”，因为两个蛋白即使形成复合物，荧光基团之间的距离或取向不合适，也可能检测不到能量转移。

适合：活细胞互作、刺激前后动态变化、亚细胞定位相关互作和蛋白构象变化。

如果现在只有一个问题——A和B在细胞里有没有互作？先做Co-IP通常最直接。

如果Co-IP阳性，接下来要证明A和B是不是直接结合，可以用纯化蛋白Pull-down进一步验证；需要明确亲和力和结合动力学，再做SPR或BLI。

如果研究重点是刺激以后互作什么时候发生、在哪里发生、是否可逆，FRET更合适。

对于完全不知道互作对象的蛋白，可以先用Y2H、AP-MS等方法筛选候选蛋白，再用Co-IP、Pull-down等方法逐步验证。

在实际项目中可以参考：

Co-IP确认细胞内关联 → Pull-down验证直接结合 → SPR/BLI测定亲和力与动力学 → FRET观察细胞内空间和动态变化。