Nature｜异种皮质化：实现人神经元从细胞、环路到动物行为的完整研究链条！

异种皮质化技术

原理：通过遗传手段特异性敲除小鼠背侧、内侧原皮层（pallium），构建apallial（去皮层小鼠），新生动物颅内植入人诱导多能干细胞来源皮质类器官hCO，构建XCX异种皮质小鼠。

解决传统类器官移植两大痛点：

①完整小鼠大脑颅内空间不足；

②宿主内源神经环路与人源神经元竞争突触连接，限制人源细胞成熟、特定神经元亚型生成、长距离轴突投射，限制环路‑行为层面在体读数。

整体流程分4大模块：

①构建遗传修饰去皮层小鼠；

②繁育体系优化与模型质控；

③新生期人皮质类器官hCO手术移植；

④移植物生长、细胞组成、神经环路整合、电生理网络活性的多维度表征。

基因型：免疫缺陷SCID背景Emx1‑cre^+/-Esco2^fl/flPrkdc^scid/scid

分子机制：Emx1‑cre仅在背/内侧原皮层细胞（新皮层、海马祖细胞）表达，条件敲除姐妹染色单体黏连因子Esco2，介导分裂期靶细胞发生细胞死亡；实现新皮层、海马谷氨酸能神经元大规模耗竭，古皮层、杏仁核、丘脑、苍白球等皮层下结构保留。

繁育优化：规避雄鼠Cre生殖系重组；淘汰大部分皮层完整同窝幼崽；延迟断奶；高热量饲料；瑞士韦伯斯特母鼠代养，提升幼崽存活率。孟德尔遗传预期25%表型，实际获得23.4%去皮层子代。

繁育策略示意图：e‑loxp条件敲除Esco2构建apallial小鼠的遗传方案

全脑大体解剖：对比对照组与apallial小鼠全脑外观：apallial小鼠大脑背侧皮层结构缺失

T2加权MRI脑组织体积定量：apallial小鼠脑组织总容量下降约50%，与小鼠皮层占脑质量42%的文献估算吻合

全脑snRNA‑seq+MERFISH空间转录组：

1.背原皮层来源谷氨酸能神经元下降7倍；

2.古皮层、嗅球、皮层下细胞类群保留；

3.残存皮层GABA能神经元转录组无明显命运改变；

hCO制备：人iPSC诱导分化三维皮质类器官，体外复现人类大脑皮层神经发生；移植窗口期：体外分化30‑60天hCO；受体小鼠日龄5‑17天（新生幼鼠，中位数P10），小鼠关键神经连接建立之前开展移植。

手术方案：双侧开颅，每侧脑腔植入2枚hCO，每只小鼠共移植4块人皮质类器官，填充apallial小鼠的皮层缺损空腔；无需外源免疫抑制，依靠Prkdc^scid免疫缺陷背景。

移植流程示意图：apallial小鼠颅内植入hCO生成XCX异种皮质小鼠的完整流程

移植成功率统计（MRI评估）： 29只小鼠，3株hiPS细胞系，移植存活率86.2%；hCO存活不依赖宿主完整皮层

纵向MRI体积追踪：移植后2 3个月移植物体积扩增4.7倍；移植3个月，人源组织占皮质腔总组织体积91.9%

移植hCO在apallial空腔内，能否分化出人类皮质多种细胞亚型，是否与宿主小鼠中枢神经系统建立双向解剖连接。

1.细胞组成（snRNA‑seq+MERFISH空间转录组）

①产生人源浅层、深层谷氨酸能神经元、祖细胞、少突胶质前体细胞、星形胶质细胞，少量人GABA能神经元；

②转录组年龄预测：移植后24周hCO神经元成熟度约相当于人类妊娠晚期第二孕中期胎儿皮层；

③移植物没有形成完整连续经典大脑皮层板层结构，但是局部出现同类神经元空间聚集的自组织现象；未形成清晰的皮层分区（arealization）。

2.关键稀有亚型：L5‑ET第5层端脑外投射神经元（含VEN冯・埃科诺莫样神经元）

①XCX模型相比既往大鼠/小鼠原位完整脑移植方案，L5‑ET神经元占比提升3倍以上；体外培养类器官几乎检测不到该亚型；

②可观察到具有双极/螺旋形态的VEN样神经元（0.16%荧光标记人神经元）；

3.双向解剖连接

①顺行示踪：人源轴突投射至小鼠皮层下、上丘；人源轴突可长距离投射到小鼠颈髓（皮质脊髓样投射），普通完整脑局灶移植无法观察到脊髓投射；

②狂犬病逆行单突触示踪：宿主古皮层、丘脑、苍白球向人移植物输入突触；

③DWI弥散加权成像：移植物内部以背‑腹向纤维取向为主，不同动物间连接模式具备一致性。

XCX移植物snRNA seq：人源细胞全套皮层细胞谱系；富集L5 ET神经元；比对人胎儿皮层，评估细胞成熟度；对比体外类器官，说明移植体内微环境诱导L5 ET产生

免疫荧光形态学：鉴定VEN（冯・埃科诺莫）样大胞体双极/螺旋神经元

顺行、逆行病毒示踪、DWI弥散加权MRI：

1.人移植物接受小鼠丘脑、古皮层输入；

2.人神经元轴突投射至小鼠皮层下结构，并且延伸至颈髓；

3.DWI显示移植物内部纤维微结构组织特征

MERFISH空间转录组：移植物无全局典型层状构筑，但存在局部同类神经元空间聚集；缺乏明确皮层分区梯度

解剖连接之外，验证移植物具备功能性神经网络，重现人类发育早期环路活动特征。

宽场光学脑成像OEG：hCO提前表达hSYN1启动子GCaMP8s，特异性标记人神经元；颅骨透明化，清醒小鼠全移植物钙记录。观测到大规模同步钙爆发，活动局灶起源后在移植物内传播，爆发与小鼠口面部运动存在时间相关性。

在体LFP局部场电位记录：硅探针植入移植物，记录到和钙成像时间模式匹配的网络爆发事件，代表移植物形成协同工作的功能性神经网络。

宽场钙成像OEG：人移植物神经元自发同步钙波，活动可在移植物传播；神经活动和动物口面部行为存在耦合

在体LFP局部场电位记录：电生理层面证实移植物存在网络级同步爆发，证明形成功能性神经环路

最大创新：人源移植物的改变可以输出到动物行为终点指标。

基础行为学：apallial小鼠存在特定行为缺陷；XCX异种皮质小鼠行为介于对照组和apallial之间；部分apallial缺陷得到部分挽救（Y迷宫工作记忆恢复），但不能完全恢复至野生型水平；步态、自发行为模式仍存在异常。

疾病建模示范：发育中人源皮质缺氧损伤模型。5%低氧处理XCX小鼠，仅人源移植物出现HIF‑1α缺氧应答、胶质活化，并且出现可定量CatWalk步态行为学改变；对照组/apallial无该特异性改变。证明平台可以实现细胞分子表型+MRI影像+动物行为多水平疾病读数。

缺氧损伤模型；免疫组化HIF 1α、SWI MRI、CatWalk行为读数       证明平台可构建人源组织特异性损伤，同时获取分子、影像、行为多层次终点指标，用于疾病模拟

1.人类神经发育基础研究方向

①解决体外脑类器官短板：体外培养类器官很难复刻部分高等级人特异性神经元亚型（如L5‑ET、VEN冯・埃科诺莫神经元，这类细胞和人类社会认知、多种精神疾病高度相关）；异种皮质化体内微环境可以诱导这类稀有细胞生成，为解析人类特有神经元细胞的分子、发育、功能提供在体动物模型。

②研究人类神经环路组装：可以在活体动物记录人神经元群体网络活动，观察人神经元轴突长距离投射，研究人类神经元和其他物种宿主环路之间的交互，为人类大脑进化比较生物学提供新工具。

2.神经发育/神经系统疾病建模启发

传统hCO体外模型只能观察细胞分子层面表型；传统小鼠转基因疾病模型只能反映小鼠细胞病理；

异种皮质化平台允许遗传/环境扰动只作用于人源神经元，并且可以往下读取到活体环路活动、影像学、动物行为表型。

• 适合模拟围产期脑损伤（论文示范缺氧损伤模型，关联脑瘫运动障碍）；

• 适合小头畸形、自闭症、精神分裂症等和人皮层环路异常相关疾病；可以将基因突变的病人iPSC‑hCO移植入apallial小鼠，同时观察细胞病理+动物行为学改变，弥补单纯体外类器官缺少行为输出的短板。

提示：模型不是完全重现人类疾病，是人神经元病理在小鼠宿主背景下的代理模型，解读行为结果必须考虑小鼠皮层下环路参与。

3.治疗手段的临床前评估启发

①细胞疗法评价：针对人脑发育损伤、缺血损伤的细胞替代策略，可以利用该平台评估人源神经移植物在颅内大体积环境的存活、分化、轴突投射、环路整合效果，同时评价动物行为功能改善；

②小分子、反义寡核苷酸等治疗药物筛选：可以在完整活体动物体内，对大体积人神经组织给药，评价药物对人神经元环路活性，同时评价动物行为学获益，相比体外类器官更贴近体内复杂微环境，弥补体外无环路‑行为终点的缺陷。

4.动物实验模型设计方法论启发

①宿主组织消融+外源组织填充范式：不仅仅局限脑类器官；该“清除宿主对应组织，再植入人源组织”思路，给其他类器官体内移植研究提供范式参考，用来规避宿主内源细胞竞争；

②多模态表征的范式：做移植类器官体内动物实验，不能仅停留在免疫荧光、单细胞测序分子表征，需要串联解剖示踪、在体电生理/钙成像、活体影像、行为学多层次读数，从分子→细胞→环路→整体动物功能逐级验证；

③模型基线的重要性：必须设置apallial去皮层空移植对照组，区分“宿主脑缺失带来的固有缺陷”和“人移植物带来的rescue/新表型”，避免将宿主本身表型错误归因为人源类器官移植效应。

参考文献：Developmental xenocortication using human-derived organoids in mice