细胞污染怎么鉴别和处理？细菌、真菌、支原体全类型防控指南

细胞培养出现污染，不一定都会表现为培养液明显浑浊。细菌和真菌通常比较容易通过培养液和显微镜发现，而支原体污染往往没有明显外观变化，却可能持续影响细胞增殖、代谢、转染效率和基因表达。

发现异常后，首先根据培养液、显微镜和污染出现速度判断类型，再进行隔离和处理。

细菌增殖速度快，通常也是三类污染中最容易被及时发现的一种。

鉴别特征：

1. 肉眼观察：培养液浑浊、快速变黄是典型表现。 

污染加重后，原本清亮的培养液会变得混浊，部分培养瓶表面还可能出现薄膜。细菌大量增殖通常伴随培养液pH快速下降，因此含酚红培养基会较快向黄色变化。

2. 显微镜下：细胞周围出现大量细小活动颗粒。 

低倍镜下可见细胞间存在大量细小、闪动或运动的颗粒，高倍镜下才能进一步观察到杆状、球状等细菌形态。细胞本身则可能逐渐变圆、颗粒感增加，严重时大量脱落。

3. 时间特点：通常在污染后数天内快速加重。 

细菌繁殖速度较快，前一天培养液还比较正常，第二天出现明显浑浊并不少见。

注意：长期使用抗生素可能压低细菌增殖速度，使培养液暂时没有明显浑浊，但并不代表污染已经清除。低水平污染可能持续存在，并在撤去抗生素后重新大量增殖。

应急处理：

明确细菌污染后，普通实验细胞优先直接废弃，而不是继续加大抗生素浓度抢救。污染细胞首先与其他培养物隔离，并按照实验室生物废弃物SOP处理。

随后排查近期与污染细胞共用的培养基、PBS、胰酶、血清等试剂，同时观察同一培养箱中的其他细胞是否出现异常。污染处理完成后，再按照实验室SOP对超净台、培养箱等公共区域进行清洁消毒。

细胞培养中的真菌污染主要包括酵母和霉菌。两者在显微镜下的形态差别较大，因此不能把所有真菌污染都简单理解成“出现菌丝”。

鉴别特征：

1. 肉眼观察：培养液可逐渐浑浊，并出现漂浮物或絮状物。

酵母污染加重后与细菌类似，也会导致培养液浑浊；霉菌污染则可能出现漂浮的絮状结构。与部分细菌污染相比，真菌早期的培养液pH变化可能并不明显。

2. 显微镜下：酵母看颗粒，霉菌看菌丝。 

酵母通常表现为较大的圆形或椭圆形颗粒，部分可以观察到出芽形成的小颗粒；霉菌则常形成细长、丝状的菌丝结构，并可出现分枝或较密集的孢子团。

图2｜酵母污染细胞培养物的显微镜下表现

图3｜霉菌菌丝与孢子镜下图

图4｜细胞培养物中生长的小型真菌菌落的显微照片

3. 时间特点：早期可能不明显，污染加重后迅速扩散。 

酵母和霉菌污染初期培养液仍可能比较清亮，随着微生物不断增殖，浑浊、菌丝或漂浮物才会越来越明显。

注意：发现疑似菌丝后，不建议把培养瓶继续放回公共培养箱“再观察一天”。霉菌能够产生孢子，一旦污染扩散到公共培养区域，后续可能反复出现新的污染。

应急处理：

酵母或霉菌污染同样以废弃污染培养物为主，污染细胞应立即停止传代，并与正常细胞分开处理。

出现真菌污染后还需要重点检查培养箱水盘、层板、超净台和公共培养试剂。如果短时间内多个不同细胞系连续出现相似污染，更需要考虑公共环境或共享试剂已经成为污染源。

抗真菌剂不适合作为长期维持细胞培养无污染的常规手段。长期依赖抗生素和抗真菌剂可能掩盖低水平污染，同时还可能影响部分细胞自身的生物学状态。

支原体是细胞培养中最容易被忽略的一类污染。它不会像普通细菌一样造成明显浑浊，因此完全依靠肉眼和普通倒置显微镜很容易漏检。

鉴别特征：

1. 肉眼观察：培养液通常仍然清亮。 

支原体污染后通常不会出现典型的培养液浑浊，pH也可能没有明显异常，因此“培养液看起来正常”不能作为支原体阴性的依据。

2. 显微镜下：普通相差显微镜很难直接判断。 

支原体体积很小，常规倒置显微镜通常无法可靠识别。Hoechst等DNA染料可以观察细胞核外异常DNA信号，用于辅助判断，但日常质量控制更适合采用PCR等专门检测方法。

图5｜ Hoechst 33258 荧光染色检测细胞支原体污染 

左：无支原体污染（阴性）；右：支原体污染（阳性）

3. 时间特点：可以长期隐匿存在。 

支原体污染可以持续多个传代而不出现明显外观变化，但会影响细胞核酸合成、增殖和代谢，并可能降低转染效率、改变基因表达。

注意：常规青霉素并不能预防支原体污染，因为支原体没有细胞壁；常规细胞培养使用的抗生素组合也不能可靠清除支原体。因此，长期使用双抗并不等于细胞不存在支原体污染。

应急处理：

疑似支原体污染时，第一步是隔离细胞并进行检测，而不是根据细胞形态直接下结论。PCR检测速度较快，适合日常筛查和污染确认。

确认阳性后，如果有同一细胞系的支原体阴性冻存种子，优先废弃污染培养物并重新复苏。

对于无法重新获得的珍贵细胞，可以在严格隔离条件下采用经过验证的支原体清除方案。清除完成后仍需停止用药并重新检测，只有再次确认阴性后才能恢复正常实验使用。

单纯扔掉污染细胞并不能解决所有问题。如果污染源仍然存在，下一批细胞仍可能再次中招。

1. 新引入细胞先隔离，再进入公共培养区

外部获得或新复苏的细胞应先单独培养并完成支原体检测，再与实验室现有细胞共同操作。

2. 培养试剂尽量分装，减少多人共用同一母液

培养基、PBS、胰酶和其他常用试剂可以采用适量分装，避免多株细胞、多人操作反复进入同一个母液瓶。一旦某一瓶试剂被污染，分装可以明显缩小影响范围。

3. 不依赖抗生素维持“表面无污染”

抗生素不能替代规范无菌操作。长期使用可能掩盖低水平细菌和支原体污染，因此污染控制的重点仍然是无菌操作、环境管理和主动检测。

4. 支原体检测需要纳入常规质量控制

支原体不能依靠肉眼筛查，因此新细胞入库、重要实验开始前以及长期培养过程中，都建议根据实验室管理要求进行检测。

细胞污染的鉴别可以先抓住三个特征：细菌看“浑浊＋细小活动颗粒”，真菌看“酵母样颗粒或菌丝”，支原体则不能靠肉眼，需要主动检测。