铁死亡实验离不开诱导剂和抑制剂，但不同工具作用的位置并不相同。Erastin抑制System Xc⁻，RSL3直接影响GPX4，FINO₂则同时涉及铁氧化和脂质过氧化；Fer-1与DFO虽然都能挽救铁死亡，但保护机制完全不同。

因此，选药前首先要明确：实验希望从哪一环节诱导铁死亡，又准备通过哪些工具验证其铁依赖性和脂质过氧化特征？

图 1 丨经典铁死亡诱导剂（红色）、抑制剂（蓝色）作用通路总图

铁死亡诱导剂大致可以分为四类：限制胱氨酸和GSH供应、直接抑制GPX4、同时削弱多条抗氧化防线，以及增加铁或脂质氧化压力。

1. Erastin与Erastin2

作用靶点：System Xc⁻/SLC7A11

Erastin抑制System Xc⁻介导的胱氨酸摄取，使半胱氨酸和GSH合成减少。GPX4缺少GSH作为还原底物后，膜磷脂氢过氧化物逐渐积累。

Erastin2是Erastin的改良类似物，在部分细胞模型中活性和稳定性更好。二者适合研究SLC7A11、胱氨酸依赖以及GSH耗竭。

不过，细胞可以通过转硫途径等方式补充半胱氨酸，因此SLC7A11高表达不等于一定对Erastin敏感。培养基成分、细胞密度和处理时间也会影响实验结果。

2. IKE与柳氮磺吡啶

作用特点：从上游限制胱氨酸摄取

IKE即咪唑酮Erastin，同样抑制System Xc⁻，但代谢稳定性相对较好，因此常用于动物研究。

柳氮磺吡啶也可以降低System Xc⁻活性，但其药理作用较多、特异性有限，更适合作为辅助验证工具，不能仅凭其引起的细胞死亡认定铁死亡。

如果希望减少药物脱靶干扰，还可以使用无胱氨酸培养基，并设置正常培养、胱氨酸缺乏和胱氨酸回补组。

3. RSL3

作用靶点：GPX4

RSL3可抑制GPX4，使磷脂氢过氧化物无法及时被还原。它的作用位置比Erastin更靠近铁死亡执行阶段，适合判断细胞是否依赖GPX4维持膜脂稳定。

有些细胞对Erastin不敏感，却对RSL3敏感，说明它们能够维持上游半胱氨酸或GSH供应，但仍然依赖GPX4。相反，对RSL3不敏感也不代表不会发生铁死亡，FSP1、DHODH和GCH1–BH4等旁路可能提供补偿。

4. ML162与ML210

作用特点：交叉验证GPX4依赖

ML162和ML210也是常用的GPX4抑制工具。若RSL3、ML162或ML210等结构不同的化合物均能引起脂质过氧化，并且可以被Fer-1或Lip-1挽救，更能支撑GPX4依赖性铁死亡。

这些化合物主要用于机制研究，其稳定性、体内暴露和安全性存在局限，体外有效不能直接等同于具有临床治疗价值。

5. FIN56与FINO₂

作用特点：同时影响多条氧化防线

FIN56可促进GPX4蛋白减少，并影响甲羟戊酸途径和辅酶Q相关代谢。它适合研究GPX4与辅酶Q防线之间的关系，但不适合用来证明单一靶点。

FINO₂不直接抑制System Xc⁻或结合GPX4，而是通过铁氧化、脂质过氧化及GPX4间接失活诱导铁死亡。由于作用较为复合，实验中应同时设置铁螯合剂和脂质自由基捕获剂。

6. 铁负荷与PUFA补充

作用特点：增加氧化反应原料

FAC、柠檬酸铁或血红素等可增加细胞铁负荷，扩大游离铁池；花生四烯酸等PUFA则可增加易氧化膜脂底物。

但铁过载和高浓度脂肪酸也可能造成一般性氧化损伤或脂毒性。因此，这类处理更适合用于增敏和机制验证，不宜单独作为确认铁死亡的依据。

图 2 丨铁死亡诱导剂四大分类及对应靶点

图 3 丨铁死亡各类诱导剂、铁死亡抑制剂化学结构对比

理想的验证方式不是只用一种抑制剂，而是同时选择两类机制不同的工具：一类阻断脂质自由基反应，另一类降低活性铁水平。

1. Ferrostatin-1

作用方式：捕获脂质自由基

Ferrostatin-1简称Fer-1，可以阻断膜脂过氧化链式反应，是细胞实验中常用的铁死亡挽救剂。

如果Fer-1能够恢复细胞存活并降低C11-BODIPY氧化，说明脂质自由基参与了细胞死亡。但Fer-1本质上属于抗氧化型工具，单独挽救不能排除所有其他氧化性损伤。

2. Liproxstatin-1

作用方式：限制脂质过氧化扩散

Liproxstatin-1简称Lip-1，作用与Fer-1相近，也可捕获脂质自由基。它可用于细胞和动物模型，在部分体内条件下稳定性相对较好。

Fer-1与Lip-1通常选择一种作为主要挽救剂，必要时再用另一种复核。二者能够阻断脂质过氧化，但并不会直接恢复GPX4活性。

3. DFO及其他铁螯合剂

作用方式：降低可参与氧化反应的铁

去铁胺DFO通过结合铁，减少铁参与自由基反应的机会。若DFO能够降低脂质过氧化并挽救细胞死亡，可为铁依赖性提供支持。

DFP、地拉罗司等铁螯合剂在膜通透性和亚细胞分布上有所不同，可根据模型选择。铁螯合剂也会影响细胞增殖、铁代谢和缺氧信号，因此应设置单独处理组。

4. NAC、GSH与维生素E

可以辅助判断，但特异性有限

NAC可补充半胱氨酸来源并增强细胞还原能力，GSH及其衍生物也可能减轻氧化损伤。维生素E和Trolox则可以终止脂质过氧化链式反应。

这些工具同时影响多种ROS相关过程，如果NAC或维生素E能够挽救细胞，只能说明氧化损伤可能参与其中，不能单独证明发生了铁死亡。

图4丨 三大抗铁死亡防线与抑制剂作用位点

细胞可能同时启动多种死亡程序，除铁死亡抑制剂外，还可以根据研究目的加入：

Z-VAD-FMK或Q-VD-OPh：评估凋亡；

Necrostatin-1s：评估RIPK1相关坏死性凋亡；

GSK'872：干预RIPK3；

Necrosulfonamide：在人源细胞中干预MLKL相关过程；

VX-765：辅助评估部分焦亡过程。

这些抑制剂没有挽救作用，并不能单独证明铁死亡；但与Fer-1、Lip-1和DFO的结果结合后，可以帮助排除主要竞争性死亡方式。

如果不同抑制剂都只能部分挽救，还应考虑混合型死亡，而不是强行归为单一类型。

图5丨 铁死亡、凋亡、焦亡、坏死性凋亡对应特异性抑制剂对比

1. 建立经典阳性模型

可分别使用：

Erastin或Erastin2：建立System Xc⁻抑制模型；

RSL3或ML210：建立GPX4抑制模型；

Fer-1或Lip-1：验证脂质过氧化依赖；

DFO：验证铁依赖性。

同时设置一个上游诱导剂和一个下游诱导剂，有助于判断待研究分子作用于哪一层。

2. 研究SLC7A11与GSH代谢

优先选择Erastin、IKE或胱氨酸缺乏，并检测胱氨酸摄取、GSH水平和脂质ROS。随后观察胱氨酸、NAC或GSH补充能否产生保护，再用RSL3判断下游GPX4防线是否仍然敏感。

3. 研究GPX4依赖

可使用RSL3、ML162或ML210，并配合Fer-1和DFO。如果细胞对GPX4抑制不敏感，还可以检测FSP1、DHODH和GCH1–BH4等旁路防线。

4. 判断未知药物是否诱导铁死亡

建议至少设置：

溶剂对照；

待测药物；

待测药物＋Fer-1或Lip-1；

待测药物＋DFO；

经典铁死亡阳性对照；

其他死亡方式的抑制剂对照；

各抑制剂单独处理组。

随后结合细胞死亡、脂质ROS、活性铁及挽救结果建立证据链。

图 6丨 铁死亡标准挽救实验结果示例

同一种诱导剂在不同细胞中的有效浓度可能相差较大，受到SLC7A11、GPX4、FSP1和ACSL4表达，以及培养基成分、血清批次、细胞密度和培养方式等因素影响。

因此，实验前应进行剂量—时间预实验，选择能够产生适度死亡、同时保留明显挽救空间的条件。如果诱导剂已经造成接近完全死亡，再加入抑制剂往往很难评价保护效果。

在已发表铁死亡相关研究中强调，单一指标不足以确认铁死亡。基础证据组合可以包括：

证明处理引起细胞死亡，而不只是代谢活性下降；

证明膜脂过氧化增加；

Fer-1或Lip-1能够产生挽救；

DFO等铁螯合剂能够产生保护；

排除明显的凋亡、坏死性凋亡或焦亡；

使用结构不同的工具重复关键结果；

条件允许时加入基因敲低、敲除或回补实验。

选工具的关键，是明确它在证据链中回答什么问题：

Erastin适合研究胱氨酸摄取和GSH耗竭，RSL3适合观察GPX4依赖，FIN56和FINO₂适合研究复合型氧化压力；Fer-1与Lip-1用于阻断脂质自由基，DFO用于检验铁依赖性，NAC和维生素E更适合作为辅助性抗氧化对照。

一种药物导致细胞死亡，不等于已经证明铁死亡；一种抑制剂能够挽救，也不能代替完整的机制验证。