肠类器官的三维荧光染色与共聚焦成像：通用型实验操作详解！

此文献提出一套简便的实验流程，可实现4项核心目标：

① 完成含热诱导抗原修复（HIER）步骤的免疫染色；

②保留类器官的完整天然形态；

③将样本固定于高分辨率/短工作距离物镜可及的焦平面内；

④最大程度降低珍贵样本的丢失风险。

1. 隐窝分离相关试剂

① 2mMEDTA解离液（pH=8.0）

• 0.5MEDTA储备液：93.05gEDTA二钠盐溶于500mL超纯水，NaOH调pH至8.0，4℃避光储存。

• 工作液：储备液用DPBS稀释250倍，终浓度2mM。

② 组织解离缓冲液

• 43.4mM蔗糖：7.43g蔗糖定容至500mL超纯水。

• 54.9mMD-山梨醇：5g山梨醇定容至500mL超纯水。

• 使用前等体积混合两种溶液，现配现用。

③基础培养缓冲液

• DPBS（无Ca²⁺/Mg²⁺）、DMEM高糖培养基、100×青链霉素+抗真菌混合液、胎牛血清（FBS）。

2.类器官传代试剂

• 基质胶：低生长因子无酚红Matrigel（GFR）。

• 细胞回收液（CorningCellRecoverySolution）。

• TrypLEExpress1×消化酶。

• 人肠类器官专用培养基IntestiCultOGMHuman。

3. 免疫染色全套缓冲液

①60×柠檬酸盐抗原修复储备液（pH=5.7）

柠檬酸9.15g+二水合柠檬酸三钠70.35g+Tris碱2.4g，超纯水定容至1L，4℃保存。

②1×抗原修复工作液（250mL体系）

25mL60×柠檬酸盐储备液+675μL20%TritonX-100+超纯水定容至250mL。

③类器官洗涤封闭缓冲液OWB（1L）：PBS1L+TritonX-1001mL+BSA2g，4℃储存，可保存1周。

④4%多聚甲醛固定液：4g多聚甲醛溶于100mL预冷PBS，现配现用，4℃避光。

⑤DAPI核染工作液：DAPI储备液1mg/mL，OWB1:1000稀释，现配现用。

⑥组织透明化试剂：RapiClear1.49（直接原液使用，无需稀释）。

阶段1：人十二指肠肠隐窝分离（总耗时3h，全程冰上4℃操作）

1.样本收集：十二指肠活检组织放入无菌无钙镁PBS中。

2.清洗：含1×抗生素-抗真菌剂的PBS轻柔旋转洗涤3次，每次2min。

3.黏膜松解：活检组织移入15mL离心管，加入2mMEDTA溶液，低速旋转孵育1h。

4.沉降弃上清：静置10s，弃去底部组织沉淀上方全部上清。

5.解离收集隐窝：加入1mL解离缓冲液转移至2mL冻存管，剧烈手摇；静置30s，吸取含隐窝上清至15mL离心管；重复吹打收集2~3次，保证隐窝完全回收。

6.中和终止：收集液加入5mLDMEM（含1%青链霉素、20%FBS）

7.离心富集：4℃、400g离心8min，弃上清。

8.洗涤过滤：2mLDMEM重悬沉淀洗涤1次，70μm细胞筛过滤去除大块组织残渣。

9.二次离心：4℃、400g离心7min，弃上清。

10.基质胶铺板：预冷GFR基质胶20~30μL重悬细胞沉淀，每孔25~30μL接种至96孔平底培养板。

11.胶聚合：37℃、5%CO₂孵育10min，待基质胶凝固。

12.加培养基：加入37℃预热IntestiCult肠类器官完全培养基（含1%双抗），进入培养阶段。

阶段2：肠类器官长期培养与传代（培养周期7~14d）

1.日常换液规则

• 第1~6天：每48h更换一次完全培养基。

• 第7天至传代：每日更换新鲜培养基。

2.传代标准化步骤

①吸除孔内全部旧培养基。

②每孔200μL细胞回收液，冰上孵育40min溶解基质胶。

③全部类器官悬液转移至15mL离心管，400g离心7min，弃上清。

④2mL预冷DMEM洗涤沉淀1次，4℃400g再次离心弃上清。

⑤消化解离：2mLTrypLEExpress1×消化酶重悬沉淀，37℃孵育25min。

⑥终止消化：加入3mL含5%FBS的DMEM中和消化酶。

⑦吹打分散：移液器上下吹打10次，打散类器官团块（允许残留3~5细胞小簇，无需完全单细胞）。

⑧离心洗涤：400g离心7min，DMEM洗涤1次，弃上清。

⑨重悬铺板：预冷基质胶重悬沉淀，每孔接种约15000个细胞，体积20~30μL，96孔板铺板。

⑩胶凝固后加入预热完全培养基，继续培养7~14d至类器官成熟

阶段3：成像前样本预处理（分3小节，总耗时3.5h）。

1.24孔板基质胶薄层包被（30min，关键步骤）

①预冷PBS将GFR基质胶50倍稀释。

②24孔盖玻片底培养板每孔加入200μL稀释基质胶。

③37℃孵育20~30min，基质胶完全聚合。

关键质控：必须形成均匀薄层，保证所有类器官贴附在同一焦平面；高分辨率成像强制选用盖玻片底培养板。

2.成熟肠类器官回收转移（3h）

①吸除96孔板中类器官的完全培养基。

②每孔200μL细胞回收液，冰上孵育40min溶解基质胶。

③全部脱落的类器官转移至15mL离心管；原孔回收液洗涤2次，洗液并入离心管。

④4℃400g离心7min，弃上清。

⑤DMEM洗涤沉淀1次，再次离心弃液体。

⑥培养基重悬类器官沉淀（含药物处理组加入对应药物培养基）。

⑦吸除24孔包被板内多余PBS，每孔加入200μL类器官悬液。

⑧37℃孵育1.5~2h，使类器官牢固贴附于基质胶薄层表面。

3.样本固定（1h）

①吸除孔内培养基，37℃预热PBS快速洗涤1次。

②预冷4%多聚甲醛4℃固定45min（通风橱操作）。

③预冷PBS洗涤1次。

④可选：样本4℃PBS短期保存，1周内完成染色；无需抗原修复的抗体直接进入透化封闭步骤。

阶段4：微波热诱导抗原修复+透化封闭（过夜，总耗时≈24h）

1.完全吸除孔内PBS，每孔加满1×柠檬酸盐抗原修复缓冲液（室温）。

2.剩余修复缓冲液微波炉900W煮沸备用。

3.培养板放入微波炉，900W加热至沸腾（约30s）。

4.弃孔内缓冲液，替换为煮沸的热柠檬酸盐缓冲液；重复煮沸-换液操作3次。

5.调低功率至90W，持续加热15min。

6.再次900W高温煮沸3次，完成抗原修复。

7.室温冷却培养板10~15min，蒸馏水洗涤1次。

8.每孔加入OWB缓冲液，4℃避光过夜，同步完成透化与封闭.

阶段5：免疫荧光一抗、二抗孵育（总耗时48h）

1.一抗孵育（过夜）

①OWB稀释对应一抗，每孔加入300μL一抗工作液。

②4℃避光孵育过夜。

③OWB洗涤2次，每次5min，去除未结合一抗。

2.二抗孵育（过夜）

①OWB稀释荧光二抗，每孔300μL二抗工作液。

②4℃避光孵育过夜。

③OWB洗涤2次，每次5min。

3.细胞核DAPI染色（≥1h）

①DAPI储备液1:1000用OWB稀释，每孔300μL。

②室温避光孵育至少1h。

③OWB洗涤2次，蒸馏水洗涤1次，彻底吸干孔内水分。

阶段6：组织透明化与共聚焦成像

1.透明处理：每孔滴加3滴RapiClear1.49透明化试剂，室温避光静置2h（或过夜）。

关键质控：不透明化仅能观察类器官表层细胞，无法完整三维成像

2.共聚焦显微镜采集：蔡司LSM800倒置共聚焦，405/488/561/640nm四激光通道，10×Plan-Apochromat物镜。

3.成像参数：连续Z-stack层扫采集完整类器官三维信号。

4.图像后处理：Zen3.5软件采集原始图像，Imaris软件完成三维重构。

1.24孔板基质胶必须是均匀薄层，否则类器官贴附焦平面杂乱，高倍物镜无法完整成像。

2.抗原修复缓冲液必须分多次高温煮沸替换，单次加热无法充分暴露MUC2、OLFM4、LYZ等胞内抗原。

3.透明化步骤不可省略，致密肠类器官会产生严重光散射，深层荧光信号完全丢失。

4.全程类器官贴壁固定于培养板，HIER高温、多次洗涤不会脱落，大幅降低珍贵样本损耗。

5.最低样本量：单孔仅需10个完整肠类器官即可完成整套染色，适合微量稀缺样本研究。

1.样本牢固贴附于培养板底部，染色完成后无法剥离，不能适配光片显微镜成像。

2.仅适配10倍物镜成像，96孔板因底厚度限制无法使用该流程。

3.本文仅验证肠类器官（enteroids），其他肝、脑、肿瘤类器官需微调缓冲液与修复时间。

4.部分膜表面标志物（如ZO-1）无需HIER修复，抗原修复反而会破坏其染色信号，需预实验区分抗体类型。