【五分钟讲实验】96孔板类器官药敏实验 Protocol：从铺板、加药到结果分析

类器官药敏实验是肿瘤类器官研究中常用的体外药物反应评估方法。相比单纯观察形态变化，标准化的 96 孔板药敏实验可以结合药物浓度梯度、复孔设计和定量读数，更系统地比较不同处理条件下类器官的反应差异。

本文以“已建立、可稳定传代的肿瘤类器官”为前提，梳理一套适用于 96 孔板体系的常见药敏实验流程，重点覆盖类器官悬液准备、铺板、药物处理、终点检测和数据分析几个关键环节。

本流程适用于已经完成建系、能够稳定传代的肿瘤类器官，用于体外药物反应评估。

若类器官处于初建系阶段，或存在明显污染、坏死、形态差异过大等情况，不建议直接进入药敏实验。

实验前应尽量保证：

1. 类器官处于稳定生长期；

2. 同一批实验使用相近传代数的样本；

3. 类器官大小相对均一；

4. 铺板前活率较高；

5. 不同处理组的接种密度保持一致。

其中，接种密度、基质胶体积、药物浓度梯度和终点检测时间，是影响药敏结果稳定性的核心因素。

加药前一天，需要将类器官从原培养体系中回收，并制备成适合铺板的小团块或细胞团悬液。

1. 去除旧培养基

吸去原培养孔中的旧培养基，操作时尽量避免直接吸走基质胶中的类器官；

若类器官嵌在基质胶中，可使用冷的基础培养基或类器官回收液帮助基质胶松散。

2. 回收类器官

加入适量冷的基础培养基或类器官回收液后，轻柔吹打，使基质胶与类器官充分分散。

吹打时动作应保持一致，避免剧烈操作造成类器官过度破碎；随后将悬液转移至离心管中。

3. 离心收集可参考以下条件：

· 300–400 g；

· 4℃；

· 3–5 min。

离心后弃去上清，保留类器官沉淀。

4. 消化与打散

根据类器官大小和紧密程度，加入适当消化液处理 5–10 min。

处理期间可间断轻柔吹打，使类器官变成较小团块或细胞团。

此步骤的目标不是完全消化成单细胞，而是获得大小相对均一、适合后续铺板的类器官片段。

5. 建议铺板前状态：

· 类器官团块大小尽量控制在 40–100 μm；

· 细胞活率建议 ≥80%；

· 同一批实验尽量保持相同处理方式。

消化结束后，加入培养基终止反应，再次离心收集类器官，并重悬计数。

药敏实验推荐使用白色不透明 96 孔板，便于后续进行发光法细胞活性检测。

若后续需要进行明场或荧光成像，也可根据检测设备选择透明底或成像兼容孔板。

1. 接种量设置，可参考以下起始条件：

· 每孔接种 3,000–5,000 个活细胞；

· 或每孔接种 50–100 个小类器官团块；

· 每孔基质胶体积 5–10 μL。

具体接种量需根据类器官生长速度、药物处理周期和检测灵敏度进行预实验优化。

2. 基质胶点胶

将类器官悬液与基质胶充分混匀后，按设定体积点入 96 孔板中。点胶时需注意：

（1）每孔胶滴体积保持一致；

（2）避免产生气泡；

（3）胶滴位置尽量居中；

（4）操作过程尽量保持低温，减少基质胶提前凝固。

点胶完成后，将孔板置于 37℃孵育 10–15 min，使胶滴充分凝固。

3. 加入培养基

胶滴凝固后，每孔加入 80–100 μL 完全培养基，加液时沿孔壁缓慢加入，避免直接冲击胶滴。

边缘孔容易出现蒸发效应，可根据实验设计选择加入 PBS 或不作为正式检测孔使用。

铺板后，将孔板置于培养箱中恢复培养 12–24 h，再进行药物处理。

铺板恢复 12–24 h 后，可开始药物处理，在药敏实验中，分组设计直接影响后续数据是否具有解释性。

1. 基础分组建议至少设置以下几类孔：

（1）空白孔：无细胞，仅含基质胶和培养基，用于背景校正。

（2）溶剂对照孔：加入与实验组相同终浓度的溶剂，例如 DMSO。DMSO 终浓度建议控制在 ≤0.1%。

（3）阳性对照孔：选择体系中已知可产生反应的药物，用于确认检测体系是否正常。

（4）实验组：加入待测药物，并设置多个浓度梯度。

2. 药物浓度设计

为获得剂量反应关系，通常需要设置 8–10 个浓度梯度，常见设计方式包括：

· 1:3 梯度稀释；

· 1:5 梯度稀释；

· 从 10 μM 等起始浓度向下连续稀释。

起始浓度应根据药物性质、文献基础和预实验结果确定。每个浓度建议设置不少于 3 个复孔。

3. 加药操作

加药时轻轻吸走部分旧培养基，避免碰到胶滴；随后加入等体积含药培养基，使各孔最终体积保持一致。

所有孔应尽量在同一时间窗口内完成加药，并记录加药时间，后续检测时间也应以该时间点为基准统一计算。

多数类器官药敏实验可在加药后 72 h 进行终点检测。

若类器官生长较慢，或药物作用较缓慢，也可延长至 5 天，但同一批实验的检测时间必须保持一致。

1. 明场成像

检测前可先进行明场拍照，记录类器官形态变化，包括：

（1）类器官数量；

（2）大小变化；

（3）边缘完整性；

（4）结构崩解情况；

（5）是否出现明显碎片或坏死样改变。

明场成像可以帮助解释活性读数，但不建议只依赖形态观察作为最终判断依据。

2. 细胞活性检测

可采用 3D 细胞活性发光法进行定量检测，参考流程如下：

（1）检测前将试剂和孔板平衡至室温；

（2）每孔加入与培养基等体积的 3D 活性检测试剂；

（3）振荡裂解 5 min；

（4）室温避光孵育 20–30 min；

（5）读取发光值。

若类器官包埋在基质胶中，应确保裂解充分，否则可能影响读数稳定性。

3. 补充验证

根据实验目的，可进一步进行 IF、IHC、qPCR 或其他分子检测，用于观察增殖、凋亡或相关通路变化。

如果药敏实验用于机制研究，建议不要只停留在活性读数，而应结合标志物检测或通路分析。

图：患者来源肿瘤类器官药物筛选结果示例

1.细胞活性百分比可按以下公式计算：

活性% =（药物孔读数 - 空白孔读数）/（溶剂对照孔读数 - 空白孔读数）×100%

完成数据归一化后，可进一步绘制剂量反应曲线，并计算 IC50 或 AUC。

2.质控建议：

（1）溶剂对照孔 CV 尽量控制在 20%以内；

（2）空白孔背景不宜过高；

（3）同一浓度复孔差异过大时，应回看铺板密度、胶滴体积和加药操作；

（4）若边缘孔波动明显，应考虑蒸发效应；

（5）若整体信号偏低，应检查类器官状态、铺板量和试剂裂解效率。

类器官药敏实验中，以下细节最容易影响结果：

1. 每孔初始细胞数不一致；

2. 类器官团块大小差异过大；

3. 基质胶体积不统一；

4. DMSO 终浓度不一致；

5. 加药后培养时间不一致；

6. 边缘孔蒸发未控制；

7. 只设置单一浓度，无法分析剂量反应；

8. 只看形态变化，缺少定量读数；

9. 复孔数量不足；

10. 不同传代数样本混用于同一批实验。

96孔板类器官药敏实验从类器官悬液准备、接种密度、基质胶体积，到药物浓度梯度、复孔设置、检测时间和数据归一化，每一步都会影响最终读数。

对于药物筛选或体外药物反应评估来说，建议在正式实验前先完成小规模预实验，确定合适的接种量、检测时间和药物浓度范围，再进入正式药敏检测。

注：涉及人源样本的研究需符合伦理审批和生物安全要求。本文参数仅作为常见起始条件参考，具体实验方案应根据类器官来源、药物性质、培养体系和研究目的进行优化。