人肠道类器官制备及微生物共培养实验流程（一）
时间：2026-06-23 阅读：102
⚠ 关键提示：肠道类器官注射可在最接近生理状态的条件下开展共培养，但该方案的标准化与可扩展性存在局限。以下介绍类器官单层培养与分化的共培养方案。
1.用含5%（体积分数）BME的DMEM溶液包被96孔板底部或24孔Transwell小室，37℃孵育30分钟。Transwell 小室可实现细胞层的顶端与基底侧双通路暴露，而标准细胞培养板可实现最高的实验通量。
2.包被完成后移除上清，将培养板置于培养箱中继续干燥15~30分钟。
3.取1mL冷DMEM收集培养的类器官，转移至15mL离心管中，补加冷DMEM至10mL。
4.300g离心5分钟，弃上清。
5.按照已报道的方法将类器官消化为单细胞悬液。
6.用含10µMRho激酶抑制剂的扩增培养基重悬细胞，调整密度为 1 000000 个细胞 /mL。
7.取100µL细胞悬液接种于经组织培养处理的96孔板中，或直径 6.5 mm的Transwell小室中，每孔细胞数为100000 个。
8.静置培养2天，使细胞贴壁。
9.培养3天后或细胞层接近汇合时，根据实验需求更换为分化培养基。
10.细胞达到汇合状态后，在适宜的暴露培养基中将微生物加入顶端或基底侧。计算 MOI时，可收集代表性孔的细胞进行计数，方法同前。
11.参照三维共培养的方法开展后续检测。
显微注射用类器官制备
1.注射前约10天：取一孔长满的24孔板类器官（约300000个细胞或150个直径约300µm的类器官），按照机械剪切类器官。通过窄口玻璃巴氏吸管反复吹打，保证类器官片段大小均一。将类器官低密度接种（每个约20μL的BME穹窿接种约30个类器官片段），24孔板每孔接种1个穹窿。
除三维共培养外，也可将类器官接种于Transwell小室，用于单层细胞暴露实验。
⚠关键步骤：接种密度取决于下游实验用途。一般原则是，接种密度约为标准类器官培养的1/10，以保证多数类器官可完成注射。适宜密度见图2g，图2k为常见的密度过高、难以高效注射的类器官培养状态。
2.培养类器官至平均直径＞200µm（机械剪切后通常需5~10天）。若类器官接种过密，可在计划注射前约3天，用剪口的P1000吸头轻柔重悬，按更高稀释度传代至新培养板。
⚠关键步骤：囊状类器官是保证注射效率的核心。应选择呈囊状生长的类器官系，并使用最优培养基条件¹⁶开展注射实验。不适宜注射的类器官状态示例见图2i~k。
3.注射前3天：更换为无抗生素培养基，保证抗生素充分从BME穹窿中扩散出去。注射前1天，再次更换新鲜无抗生素培养基。
细菌制备
4.从冻存菌液中取菌接种至适宜培养基，37℃、180rpm振荡过夜培养。
5.将过夜培养的菌液按1:10比例转接至新鲜培养基，继续培养至细菌进入指数生长期，且菌量满足注射需求（多数菌株1mL培养基OD值0.4~0.6即可满足需求）。
⚠关键步骤：对于专性厌氧菌，需使用厌氧培养箱或同等设备培养细菌。全程使用无氧培养基，且直至注射前所有操作均维持无氧环境。
6.3000g离心10分钟收集细菌，弃上清。
7.用10mLDMEM重悬洗涤，重复离心步骤（步骤6）。
8.可选步骤：若需通过荧光显微镜鉴定共培养中的细菌（步骤43~45），按下述方法对细菌进行荧光标记：
用10mLPBS洗涤细菌沉淀2次，去除残留蛋白.
⚠关键步骤：洗涤不充分会导致后续步骤染料无法进入细胞。
加入20µM新鲜配制的荧光染料，孵育45分钟（染料选择见“试剂配制”部分表格）。
用10mLPBS洗涤1次。
9.用一定体积（V）的DMEM重悬细菌沉淀（通常为0.250mL，见“实验设计”部分），调整至适宜注射的浓度（见步骤10~21）。
感染复数（MOI）的确定
⚠关键提示：计算MOI需同时估算细菌与类器官的细胞数量。由于类器官存在异质性，目标MOI基于平均大小的类器官计算，单个类器官的实际MOI会存在小幅差异。
确定每个类器官的细胞数换算系数
10.在明场显微镜下计数一个代表性BME穹窿中的类器官数量。
11.用P1000移液器收集该穹窿的类器官，按照文献方法消化为单细胞悬液¹⁶（基础方案5）。
12.使用标准血细胞计数板计数该穹窿消化得到的单细胞总数。
13.用细胞总数（步骤12）除以穹窿内类器官数（步骤10），计算得到每个类器官的细胞数换算系数（Co）。处于最佳注射状态的类器官，Co通常约为1000个细胞/类器官。
确定细菌细胞数量
对于部分细菌物种，600nm处光密度值（OD600）与细菌数量的换算系数已明确（如大肠杆菌），可直接作为ODc使用。但由于仪器与菌株差异，建议按下述方法建立菌株特异性的OD600-细菌数换算系数，且仅在OD与菌数的线性范围内使用该系数。
为建立细菌光密度换算系数（ODc），培养细菌液体培养物，测定其OD600值（OD1）。稀释后涂布平板，根据菌落数Cb计算换算系数。
14.培养细菌至OD600为0.1~1.0，梯度稀释后涂布平板，培养1~2天后计数菌落，建立OD值与细菌数的换算关系：
ODc=OD1×D×VpCb
式中：
ODc：OD600与菌落数的换算系数
Cb：实际观测菌落数
OD1：原菌液的OD600值
D：原菌液的稀释倍数（如10倍稀释则为0.1）
Vp：涂布体积
15.建立换算系数ODc后，即可通过测定收获菌液的ODm，计算细菌总数，确定注射所需的稀释比例。将收获菌液的体积与测得的ODm乘以换算系数ODc，得到收获的细菌总数（B）：
B=ODc×ODm×Vh
式中：B为细菌总数，ODc为OD-菌落数换算系数，ODm为测得的菌液OD值，Vh为收获的菌液体积。
确定注射体积
16.用微量上样针取1µL含0.05%（质量体积比）固绿染料的DMEM溶液，加入显微注射针中，将针头安装至显微注射仪（c）。
17.以约60°角切割针头开口，保证后续穿刺类器官与释放细菌的效果最佳（d）。
18.向盛有PBS的培养皿中反复注射，直至针内液体完全排出。
19.用排出的总体积除以排空针头所需的注射次数，计算得到单次注射体积（Vs）。根据我们的经验，Vs为2~20nL时，适合注射不同大小的类器官。若Vs偏离该范围，调整注射压力或针头切割程度。
20.按平均每个类器官注射5针计算，计划注射体积（Vo）为Vs×5。
稀释细菌至目标MOI
21.将定量的细菌沉淀（总数B）重悬于体积为V的含0.05%（质量体积比）固绿染料的DMEM中，以便观察注射效果。为达到目标共培养MOI（MOIt），体积V按下式计算：
V=MOIt×CoB×Vo
式中：V为重悬细菌沉淀的体积，B为沉淀中细菌总数，Vo为平均每个类器官的注射体积，MOIt为目标感染复数，Co为平均每个类器官的细胞换算系数。
显微注射
耗时：实操与总时长取决于待注射类器官数量；每个穹窿约5分钟。
22.用微量上样针吸取10μL细菌注射混合液，转移至显微注射针中，将针头安装至显微注射仪。
23.以约60°角切割针头开口，保证穿刺类器官与释放细菌的效果最佳（见步骤17与图d,e）。
24.将盛有类器官的培养板置于生物安全柜内的体视显微镜下。
25.用针头穿刺单个类器官，将定量的细菌-染料混合液注射至管腔中（图f）。若注射后出现大量染料渗漏至类器官外，该孔应弃用。
26.注射完成后立即及后续数日内，通过明场显微镜观察注射染料（图g）与细菌，统计成功注射的类器官比例。注射染料通常在数天内扩散消失，但细菌会在类器官管腔内形成可见的浑浊团块（图2h）。
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