患者来源类器官的通用实验操作流程参考！

本文介绍了建立患者来源类器官的通用实验方案，该方案可应用于多种上皮组织。

注意：涉及原代人体组织材料的研究必须遵守所有相关机构和政府法规。所有受试者在收集原代人体组织材料前必须签署知情同意书。

1.组织取材收集

①按活检部位和/或组织类型（即正常组织和肿瘤组织）分开，将原代人体组织碎片收集于50ml锥形管中，加入45ml冰浴的adDMEM/F12+++培养基。（可选）向adDMEM/F12+++培养基中添加10μMROCK抑制剂以提高细胞存活率。将组织样本置于该培养基中，4℃保存直至开始分离。

②根据原代组织来源的不同，组织碎片可在4℃保存长达72小时，且类器官生长效率无显著损失，但理想情况下应尽快进行后续步骤。

③评估所获组织碎片是否仅含上皮组织，或是否还含有脂肪或肌肉组织。若含有非上皮成分，在解剖显微镜下使用手术剪或手术刀和镊子尽可能去除。若无非上皮成分，立即进行下一步。

2.关键步骤：非上皮材料可能会减慢单细胞消化速度，或导致对具有类器官形成能力的（上皮）细胞数量的高估。

①在10cm细胞培养皿中，使用手术剪或手术刀将组织切碎为1-3mm³的小碎片。

②取1-2块代表性碎片固定于固定液（即10%（质量体积比）福尔马林或4%（质量体积比）多聚甲醛）中，用于组织学分析。

③取部分碎片速冻于-80℃，用于分子生物学（即全外显子组/基因组测序或mRNA测序）或生物化学（即蛋白质免疫印迹或蛋白质组学）分析。这些碎片也可用于分离DNA，通过SNP/STR指纹图谱进行质量控制/验证患者来源。

①根据肿瘤类型对所得组织进行适当消化。密切监测消化过程，对于孵育时间<2小时的样本，每10-15分钟剧烈摇晃并使用P1000移液器上下吹打混合物以混匀。对于过夜孵育的样本，将混合物置于摇床上。消化过程中添加10μMROCK抑制剂可提高生长效率。对于头颈部类器官，消化时间不应超过1小时，并需定期监测。

关键提示：密切监测消化过程，过度消化会显著降低生长效率。一般来说，当观察到由2-10个细胞组成的细胞团混合物时，消化即完成。当开始培养一种新的组织类型时，建议在消化过程中取少量消化物进行接种，以确定该特定组织的最佳平均消化时间。

②当混合物变浑浊且剩余组织碎片被破碎后，用P1000移液器上下吹打10-20次进一步辅助组织破碎。加入10mladDMEM/F12+++培养基洗涤一次，4℃、200g离心5分钟。

③将沉淀重悬于10mladDMEM/F12+++培养基中，用100μm细胞筛过滤。

④将重悬并过滤后的细胞悬液4℃、200g离心5分钟。

⑤吸去上清，将沉淀重悬于BME或基质胶中。BME需置于冰上以防止凝固，因此操作要迅速。BME的用量取决于沉淀的大小，约每10000个细胞接种于40μlBME中。

关键提示：不要过度稀释BME（BME体积分数应>70%），以确保形成坚实的液滴。

⑥将含类器官的BME以每滴约10μl的体积接种于预热的24孔悬浮细胞培养板底部，每孔接种3-4滴。

关键提示：

类器官重悬于BME后，应尽快进行接种，因为BME可能会在试管或移液器吸头中凝固。

培养板应提前置于37℃湿润培养箱中过夜预热。若预热不充分，BME液滴会在培养板表面立即变平，类器官更容易贴附于培养板底部。

不要直接将培养基加在BME液滴上方，以免破坏液滴。

⑦将培养板置于37℃、5%（体积分数）CO₂的湿润培养箱中培养。

⑧每2-3天小心吸去孔中的培养基，更换为新鲜的预热培养基。在培养物的前两次传代中，培养基中需保留ROCK抑制剂和Primocin（头颈部类器官还需保留卡泊芬净）。

关键提示：

BME液滴可能会从悬浮板上脱落并在培养基中“漂浮”。在这种情况下，建议不使用基于TrypLE的类器官解离方法，直接重新接种类器官。密切监测类器官的形成情况。理想情况下，首次传代应在初始接种后12-14天进行。

不要过早进行传代，否则可能导致培养失败。

在最初的传代中，确保培养物的最佳密度（一般经验法则为每40μl接种10000个细胞），即使这意味着需要重新接种材料以减少孔数。

①上下吹打以破碎BME或基质胶，将类器官悬液转移至15ml锥形管中。

②加入10ml冰浴的adDMEM/F12+++培养基至满管，以辅助去除BME。

③4℃、200g离心5分钟收集类器官。

④吸去上清，根据类器官类型选择传代方法：使用TrypLE（适用于头颈部以及致密的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官）或机械破碎（适用于卵巢以及囊性的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官）。

TrypLE细胞解离法：将沉淀重悬于1mlTrypLE中，上下吹打，37℃孵育直至类器官解体。每3-5分钟用套有P10吸头（无滤芯）的P1000滤芯吸头上下吹打≥10次，辅助破碎类器官。密切监测消化过程，尽量缩短TrypLE的孵育时间。

机械破碎法：将沉淀重悬于3mladDMEM/F12+++培养基中。用套有P10吸头（无滤芯）的P1000滤芯吸头上下吹打类器官悬液30次。利用管底产生的压力辅助破碎类器官。

关键提示：TrypLE解离时间不要超过15分钟，否则会导致类器官生长不良甚至培养失败。一般来说，当观察到由2-10个细胞组成的小细胞团混合物时，消化即完成。

关键提示：若为药物筛选做准备，消化不完全导致的大细胞团或完整类器官碎片，会在制备药物筛选用类器官悬液时被过滤掉，从而导致类器官产量降低。

⑤破碎完成后，加入10mladDMEM/F12+++培养基洗涤。

⑥将类器官沉淀重悬于70%（体积分数）BME中，按照步骤10-13所述方法，以小液滴形式接种于预热的培养板底部。接种完成后，翻转培养板，置于37℃、5%（体积分数）CO₂的湿润培养箱中30-60分钟。

⑦将含10μMROCK抑制剂的类器官培养基预热至37℃。

⑧BME液滴凝固后（30-60分钟），小心地将预热的培养基加入孔中。

关键提示：不要直接将培养基加在BME液滴上方，以免破坏液滴。

⑨将培养板置于37℃、5%（体积分数）CO₂的湿润培养箱中培养，直至需要用于药物筛选。

关键提示：药物筛选前无需冻存类器官，可直接用显微镜检查类器官，评估培养物质量，排除培养物污染的可能性后，再开始制备类器官。

①传代后2-3天，吸去培养基，向每孔加入500μladDMEM/F12+++培养基。用P1000滤芯吸头破碎BME液滴，将材料转移至冰浴的15ml锥形管中。

关键提示：为确保通过洗涤完全去除BME，一个15ml锥形管最多可合并12孔24孔细胞培养板的类器官。若使用更多材料，每个培养物需使用多个试管，后续制备筛选用类器官悬液时可再合并。（可选）若冻存更多孔或多个细胞培养板，相应调整15ml锥形管的数量。

②（可选）若BME含量较高，向装有类器官的15ml锥形管中加入adDMEM/F12+++培养基至总体积12ml，用预润（用adDMEM/F12+++润洗）的10ml血清移液管上下吹打，将试管置于冰上10分钟。再次用10ml血清移液管上下吹打数次。样本在冰上放置时间越长，BME溶解越充分。

③4℃、200g离心5分钟收集类器官。

④小心吸去上清，不要扰动沉淀。

⑤（可选）若一个类器官培养物使用了多个15ml锥形管收集，将每个试管的沉淀重悬于1mladDMEM/F12+++培养基中，全部转移至一个15ml锥形管中。再次4℃、200g离心5分钟，小心吸去上清，不要扰动沉淀。

⑥加入所需体积的无细胞冻存培养基，用P1000移液器上下吹打充分重悬类器官。

关键提示：每4个24孔细胞培养板的“原始”孔类器官使用500μl冻存培养基。

⑦每个无菌冻存管加入500μl含重悬类器官的冻存培养基。

⑧将冻存管放入冻存盒中，置于-80℃保存。

⑨-80℃保存24小时后，将冻存管从冻存盒中取出，转移至液氮罐中（约-180℃）。

①从液氮罐中取出装有冻存类器官的冻存管，置于干冰上运输。

②每个待复苏的冻存管准备一个15ml锥形管，加入10ml室温的adDMEM/F12+++培养基。

③将冻存管置于37℃水浴中孵育1-3分钟，融化含类器官的冻存培养基。

关键提示：密切监测融化过程，一旦冻存培养基完全融化，立即从水浴中取出冻存管。考虑到走到生物安全柜所需的时间，可在仍有一小块冰残留时取出。

④向冻存管中逐滴加入1mladDMEM/F12+++培养基并混匀，然后将管中全部内容物转移至15ml锥形管中。加入adDMEM/F12+++培养基至总体积10ml。

⑤4℃、200g离心5分钟收集类器官。

⑥小心吸去上清，不要扰动沉淀。

⑦再进行以下操作：

关键提示：若洗涤过程中冻存培养基的稀释倍数未达到至少10倍，应额外进行一次洗涤步骤，以确保在接种前充分稀释冻存培养基。