【五分钟讲实验】如何优化你的ELISA实验？

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的基于抗原和抗体之间特异性键的分析免疫化学测定。

ELISA实验优化过程中应测试许多因素，例如用于包衣的抗原或抗体的浓度、温度、各个步骤的持续时间、包被缓冲液的类型，例如磷酸盐缓冲盐水（PBS）或碳酸盐缓冲液）、样品制备方法（有或没有EDTA、去互补、血清或血浆或整个样品）。平板饱和也是一个需要优化的步骤，例如不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉或来自不同动物的全血清。在这里，我们将讨论优化过程中最重要的步骤。

1. 抗原涂层

① ELISA的第一步是用抗原包被孔或捕获抗体。

② 大多数情况下，这包括将PBS或碳酸盐缓冲液中的蛋白质溶液应用于微量滴板孔。用于包被蛋白质的微量滴定板是具有改性表面的特殊板，即对具有极性或亲水基团的分子具有高亲和力的高电荷聚苯乙烯表面。

③ 这种表面对蛋白质（包括球状抗体）具有很高的结合能力，并确保正确的抗体取向。另一方面，脂质抗原的ELISA在疏水表面上进行，适用于非蛋白质抗原，这些抗原不溶于PBS或碳酸盐缓冲液，但溶解在适当的酒精中。无论抗原的类型如何，都必须覆盖井底的整个表面。如果整个表面没有被覆盖，吸光度读数会降低，如果存在过量的抗体/抗原，抗体/抗原层可能会在后续步骤中形成并冲走，这再次导致信号降低。

2. 饱和阻断

① 用抗原涂覆ELISA板的过程依赖于孔固相的结合活性，该固相将生物分子固定在孔表面。之后的步骤是阻塞。在封闭过程中，孔底部的游离结合位点被封闭缓冲液饱和，以防止非特异性结合的可能性和孔的残余结合能力，从而大大提高信噪比和特异性。如果不进行适当的封闭，检测抗体可能会与抗原非特异性结合，导致高背景信号和低灵敏度。

② 每个封闭缓冲区都代表了减少背景和保持特异性之间的折衷方案。在某些情况下，全血清和血清蛋白白蛋白可引起非特异性ELISA信号。

③ 为防止交叉反应性抗体或ELISA试剂与BSA的非特异性结合导致假阳性结果，可以使用替代封闭剂，不能在封闭缓冲液中加入蛋白质。这些不同的封闭剂（以及它们的不同浓度、孵育时间等）应同时进行测试，以发现每个ELISA系统的最佳饱和方法。

3. 样品制备

稀释剂的选择很重要。通常，标准稀释剂应尽可能与样品的基质相似。

① 例如，含BSA的PBS是ELISA中良好的血清替代品，最常用于生物学样品。下一个重要的稀释剂成分是非离子去污剂（吐温20、TritonX-100、CHAPS），在低浓度下，可防止非特异性（疏水性）蛋白质-蛋白质相互作用。特异性结合通常对洗涤剂更具抵抗力。

② 如果分析物不是血清，则可能需要选择与PBS/Tween/BSA不同的稀释剂。在这种情况下，有必要检查实验样品的标准曲线和稀释线性。其原因是标准稀释剂或matix的成分对抗原/抗体相互作用的影响。在这种情况下，应进行加标回收或线性稀释实验。

③ 加标回收：将一定量的标准品加入（加标）到样品缓冲液或样品中，并与未添加标准品的样品同时测量。可以比较添加到天然测试样品基质中的相同量的分析物和添加到标准稀释剂中的相同加标值。

④ 在测试实验样品时，重要的是测试几种稀释液，全部一式两份或一式三份，并结合已知标准品进行，以确保最终结果落在标准曲线的线性部分内。这确保了结果的准确性。

⑤ 在高浓度样品中，可能会低估浓度，而在高度稀释的样品中，可能会出现高估。制备不同浓度的样品，牢记底物的检测限。在这一点上，非常适合检测可以检测的最大样品量，即最后浓度，之后吸光度没有进一步增加（与抗原涂层优化的原理相同）。这样，就可以确定方法的上限，从而优化下一步。

⑥ 如果样品是血清，则可能会出现高非特异性吸光度，这与样品/分析物的浓度无关。如果血清没有去补体，就会发生这种情况，因为活性补体与抗体Fc结合。血清在56°C下热灭活30分钟可消除补体活性，但必须记住，来自不同物种的不同免疫球蛋白同种型和免疫对白蛋白对热处理表现出不同的敏感性。因此，仔细考虑或测试灭活步骤非常重要。

4. 检测抗体的选择

① ELISA很大程度上取决于所用抗体的选择，因此应谨慎选择抗体。根据样品类型和预期的分析物浓度，选择单克隆或多克隆抗体，甚至两者的组合，应提供最佳的信噪比。每种抗体类型都具有独特的优势。

② 如果可用，应始终选择单克隆抗体而不是多克隆抗体，事实上，商业ELISA试剂盒几乎总是使用单克隆抗体。单克隆抗体对单个表位具有特异性，通常是抗原表面的一小部分。因此，单克隆抗体不太可能与密切相关的蛋白质相互作用，并且通常不会在免疫测定中触发非特异性信号。

③ 多克隆抗体是对抗原具有更高特异性的抗体混合物，因此它们结合不同的表位。商业多克隆抗体通常是亲和纯化或交叉吸附的，但交叉反应的可能性仍然更高。此外，多克隆抗体制剂可能会出现批次间差异，而单克隆抗体则不然。

④ 使用多克隆抗体的优点是，它们很少会因单个封闭的抗体结合位点、抗原构型改变或错误折叠而无法与抗原结合，尽管后者在ELISA以外的测试中更为重要。当结合单克隆抗体时，如夹心ELISA，重要的是要检查文献或通过实验测试抗体的相容性，因为它们不共享表位或空间位阻。

⑤ 由于多克隆抗体与靶抗原结合的水平较高，因此使用多克隆抗体间接检测而不是直接检测单克隆抗体可以提高ELISA灵敏度。为了降低成本，也可以将单克隆捕获与多克隆检测相结合。

⑥ 仔细选择抗体后，应仔细制备捕获抗体的连续稀释液，以适当滴定抗体浓度。根据前面提到的检测组分（在本例中为检测抗体）的最大浓度的原理进行，之后不再增加吸光度。同样，理想的浓度应提供最高的信号和最低的噪声。

5. 酶偶联物的选择

在此步骤中，第一点是根据研究人员的需要选择适当的酶偶联物。酶应在典型的测定温度下保持稳定：4°C、25°C和37°C。

① 在4°C下储存时保质期大于6个月;价格低廉且可商用。HRP和ALP是ELISA测定中用于检测的两种最广泛的酶。HRP通常以4：1的比例与抗体偶联。ALP为2：1。HRP和ALP都具有产生可溶性有色反应产物的底物。与HRP产生可溶性反应产物的最常见底物是：TMB（3,3′，5,5′-四甲基联苯胺）、ABTS（2,2′-联氮基二[3-乙基苯并噻唑啉]磺酸酯）和OPD（邻苯二胺）。

② TMB是一种高度敏感的底物，由于其反应速度快，因此非常适合在线动力学分析。TMB也可用于终点测定，方法是终止与1M磷酸的反应。ABTS被认为是一种通用基材，目前可用于过氧化物酶或碱性磷酸酶的任何底物中具有最宽的工作范围。其反应速率适用于终点测定，并且很容易用1%SDS（十二烷基硫酸钠）停止，它不会改变反应产物的颜色或吸光度。OPD曾经是过氧化物酶最流行的底物。它的敏感性略低于TMB，但具有致癌性。

③ 所有酶联免疫测定都意味着使用酶底物。比色ELISA通常需要可溶性有色反应产物。选择哪种底物取决于所需的灵敏度、反应时间和检测设备。对于比色检测，最理想的底物可快速产生颜色强烈的反应产物。当分析物的量跨越很宽的浓度范围（大动态范围）时，更适合使用在较长时间（15到30分钟）内产生颜色的底物，因为这样，人们就能够检测出更宽范围的分析物依赖性颜色强度。对于具有定时终点的测定，在定义的时间段后，使用适合特定酶底物组合的抑制剂停止反应，以停止进一步显色。在合理的时间内进行检测，具有“缓慢”反应速率（15至30分钟完成）的底物是最佳的。

④ 影响酶活性测量的因素包括温度、缓冲液组成（pH值、离子强度）、产物抑制剂的积聚、随着产物浓度的增加而增加的反反应、酶的稳定性以及有时暴露在光下。

6. 信号检测方法

ELISA的检测方法很少，但实验室中最普遍的是比色法。此外，还使用荧光灯和发光灯。

① 荧光底物的ALP和HRP可能会产生更高的信号，从而提高灵敏度和更宽的动态范围。这种检测需要黑板，黑板也具有不同程度的疏水性，并且需要荧光酶标仪。荧光产生底物的半衰期比比色底物短，因此信号会随着时间的推移而下降。这种ELISA可用于测量免疫反应，因为动态范围更宽。

② 与ALP或HRP偶联的相同检测抗体也可用于化学发光测定。在这种类型的实验中，ALP将修饰底物，形成产生光发射的化学发光产物。ALP化学发光底物可以具有pg/ml灵敏度。信号可以在黑色或白色不透明ELISA板中读取，并且需要光度计。这种检测类型的优点通常是更高的动态范围和更低的背景信号。信号不如比色或荧光检测稳定，必须在产生信号后的短时间内读取。

所用底物的类型取决于几个因素，最显著的是所需的检测灵敏度和信号与烘烤率。

ELISA是一种出色的分析方法，可用于检测和定量多种生物分子。无论这种特定的生物分子是什么，ELISA的基础都是抗原-抗体相互作用。这种特定相互作用的存在通常能够构建不同的ELISA方案。经过仔细的方案优化、验证特征的确定和适当标准品的获取，可以获得一种可靠且廉价的分析方法，适用于诊断、研究或生物医学。