【五分钟讲实验】如何做好β-半乳糖苷酶染色！

结果β-半乳糖苷酶染色（β-Galactosidase Staining）是一种常用的细胞或组织活性检测方法。这种染色方法基于衰老时SA-β-Gal（senescence-associated β-galactosidase）活性水平上调，可以对衰老细胞或组织进行染色检测。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。

1. 细胞样本染色

1.1 贴壁细胞

① 对于 6 孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用 PBS 或 HBSS 洗涤 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室温固定 15 分钟。

② 吸除固定液，用 PBS 或 HBSS 洗涤细胞 3 次，每次 3 分钟。

③ 吸除 PBS 或 HBSS，每孔加入 1 毫升 SA-β-gal 染色液。

④ 37 ℃ 孵育过夜，可以用保鲜膜封住防止染色液蒸发。

⑥ 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入 2 ml PBS，4 ℃ 可以保存数天；或者加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存较长时间。

1.2 悬浮细胞

① 离心收集细胞至 1.5 ml 离心管内，用 PBS 或 HBSS 洗涤 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室温固定 15 分钟。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。

② 离心，吸除细胞固定液，用 PBS 或 HBSS 洗涤细胞 3 次，每次 3 分钟。

③ 离心，吸除 PBS 或 HBSS，每管加入 0.5~1 毫升 SA-β-gal 染色液。

④ 37 ℃ 孵育过夜。

⑤ 取部分染色后的细胞，滴加到载玻片上或孔板内，普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以离心，去除染色工作液，然后加入 1 ml PBS，4 ℃ 可以保存数天。如果离心，取细胞用于涂片，加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存较长时间。

2. 石蜡切片样本操作

① 将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。脱蜡。二甲苯I10min→二甲苯II10min→梯度酒精(由高到低)各5min。

② 1xPBS洗涤3次，每次3-5min。

3.  冰冻切片样本操作

① 加入适当体积的-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于15min。1xPBS洗涤3次，每次5min，吸除PBS或HBSS。

② 加入适当染色工作液，37℃孵育过夜，最好把整个切片浸泡在染色工作液中。

注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。

③ 1xPBS洗涤3次，每次5min

④ 脱水:梯度酒精(由低到高)各5min→二甲苯I10min→二甲苯II10min

⑤ 中性树胶封片。

⑥ 普通光学显微镜下观察。光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达-半乳糖苷酶的细胞如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2mlPBS，4℃保存。

1. β-Gal Fixative有一定的腐蚀性和气味，操作时请注意防护。

2.. 片子有大量杂质

① 工作液需要完全融化，必要时可在 37 ℃ 烘箱中溶解，现用现配，低温会使工作液再次结晶。

② 试剂盒可能过期变质；可用 70% 乙醇轻柔冲洗几次。

3. 染色过深或过浅

染色时间、分化时间过长或不够，染色过程可在镜下控制，适当调整时间。

4. 切片染色不均

① 取材固定不当，取材规范标准，固定彻底；脱水不够，重新脱水、透明、浸蜡。

② X-Gal溶液需要现用现配。细胞固定时间过长或固定之后清洗不干净，均会影响后续的酶反应。

5. 样品固定要求

样本放置于20倍样本体积的固定液中固定24小时以上，固定时样品切勿冷冻结冰。

运输要求：固定好的样品常温运输送样；冰冻切片-20℃运输。

6. 染色液的配制

染色液应该在无菌环境下配制，以避免污染。使用聚丙烯容器配制染色工作液，不能使用聚苯乙烯容器配制，例如普通的6孔板就可以用作染色的容器。加入染色液后，可能有结晶形成影响观察，可去除染色液后，用 70% 乙醇洗涤，待结晶溶解后换成 PBS，再观察。

7.β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件，不能在二氧化碳培养箱中进行染色反应。用于细胞培养的二氧化碳培养箱中较高浓度的二氧化碳会影响染色工作液的pH值，而导致染色失败。

β-半乳糖苷酶染色实验是一种常用的细胞活性检测方法，可以用于研究细胞衰老、凋亡等生物学过程。在进行实验前，要充分了解实验原理、操作流程和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。同时，要不断优化实验条件和方法，提高实验效率和质量。