【心血管疾病模型】急性髓系白血病（AML）模型构建

白血病是造血组织的恶性增殖性疾病，其特点是骨髓及其它造血组织中大量无核细胞无限制增生，进入外周血液，临床表现以骨髓、脾、肝等造血器官中的白血病细胞恶性增生与肿大，并浸润到全身各组织脏器中，伴有不同程度的贫血、出血、感染发热以及骨骼疼痛。

急性髓系白血病（AML）是由于骨髓中干细胞和祖细胞克隆突变或异常增殖导致的一种恶性肿瘤。常用的构建AML模型方法包括体内移植模型、体外培养模型、基因编辑技术、人类病毒介导的AML模型和体外三维培养模型等。

AML 动物模型分析

AML 铁死亡相关基因的预后分析及关系网络构建

急性髓系白血病（AML）模型的构建可以利用不同种类的动物，在研究AML的发病机制、治疗方法和药物筛选等方面均有应用。

常见白血病模型所用的啮齿类动物品系

1. 实验动物

SPF级，SCID小鼠60只，雌雄各半，7~8周龄，体质量20~22g，动物房要求恒温20~22℃，恒湿60％~70％，5只1笼喂养，自然光照，自由饮纯净水，食料高压灭菌。

2. 细胞培养

取出冻存AML细胞株HL-60的冷冻管速融，37℃解冻，细胞培养箱通5%CO2，恒温37℃，解冻后HL-60接种于含100mg/L链霉素、100U/mL青霉素G和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。常规传代培养3d，EDTA消化后注入离心管，1000r/min低速离心5min，收集AML细胞株HL-60调制成细胞数密度为1×107的细胞悬液备用。

3. 造模与分组

60只小鼠随机选取其中的50只，再随机分为模型组、阿糖胞苷组、观察1组、2组和3组，另10只正常小鼠设为空白对照组。将模型组、阿糖胞苷组、观察1组、2组和3组SCID小鼠移出，在超净台上，按100mg/kg体质量的环磷酰胺腹腔注射预处理，每日1次，注射2d，第3日取备用的AML细胞株HL-60细胞悬液，均从小鼠右侧腹部皮下单点注射（1×10^7鼠），空白对照组不做处理。注射后第3周以肝脾出现肿瘤浸润、外周血白细胞达（4.03±1.92）×10^9/L为成瘤标准。

在造模的预实验中，平均成瘤时间为（14.63±2.74）d，平均生存时间达（54.36±6.97）d，说明这种方法造模简单，成瘤率高（本实验成瘤率为100%），并能更真实、直观地观察白血病细胞在肝、脾、肺等内脏器官的浸润及转移情况。

4. 给药方法

注射AML细胞株HL-60细胞悬液后第3周最后1d，观察1组、2组和3组分别用阳性药物，按10、5、2.5mL/kg灌胃5周，模型组和空白对照组灌胃等体积0.9%氯化钠注射液5周。阿糖胞苷组尾静脉注射阿糖胞苷标准品100mg/（m2·d），每日1次，共治疗5d。1.6标本采集与检测1）外周血白细胞计数及分类。在治疗结束时取尾静脉血0.1mL，用人工计数法计数白细胞、红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和HL-60细胞总数。

1. 细胞培养、复苏与冻存

1.1 细胞培养

人源性 AML 细胞系 KG1a 以含 10%胎牛血清、1×青链霉素混合液的 IMDM为培养液，培养于 5% CO2、37℃、饱和湿度的细胞专用培养箱中。细胞长至合适密度后传代培养/冻存，后续实验所用细胞均处于对数生长期。

1.2 细胞冻存

收集对数生长期 KG1a 细胞，1000rpm 离心 5min，弃上清，用 9：1 血清、DMSO 混合液柔缓吹打重悬，调整浓度至 5-10×106/ml，每支冻存管加入 1-1.5ml上述细胞混合液，注明姓名、细胞名称及时间，然后将其放置于常温细胞冻存盒中，–80℃过夜，次日放入液氮中长期保存。

1.3 细胞复苏

打开恒温水浴锅，待温度稳定为 37℃后，从液氮中取出 KG1a 细胞，放入水浴锅中化冻，冻存液完全融化后放入离心机中 1000rpm 离心 5min，结束后弃冻存液并用适量培养液重悬细胞，柔缓吹打均匀后转移至无菌培养瓶中，显微镜下观察细胞状态后将培养瓶置于 5% CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养，次日更换新的培养液。

2. 模型评价

RT-qPCR 检测 KG1a 细胞中相关基因表达情况

Western Blot 检测 KG1a 细胞中相关蛋白表达水平

CD34+CD38–KG1a细胞的分选

流式细胞仪(FCM)检测分选所得CD34+CD38–KG1a纯度

CCK8检测LSCs及Non-LSCs增殖能力