Activated Drp1 regulates p62-mediated autophagic fux and aggravates infammation in cerebral ischemia-reperfusion via the ROS-RIP1/RIP3-exosome axis

活化的Drp1调节p62介导的自噬通量，并通过ROS-RIP1/RIP3-外泌体轴加重脑缺血再灌注中的炎症

期刊：Military Medical Research

发表时间：2022

影响因子：34.915           

脑缺血再灌注损伤（CIRI）是指当缺血脑组织的血供恢复时可发生的继发性脑损伤。

CIRI是一个复杂的病理生理过程，涉及能量紊乱，细胞酸中毒，兴奋性氨基酸的释放增加，细胞内钙稳态的损失，自由基生成，凋亡基因的激活，相互因果和相互交织，形成一个恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。目前，触发CIRI恶性循环的机制仍在探索中。

线粒体功能障碍与CIRI密切相关，是脑缺血后神经细胞死亡的关键靶区。线粒体裂变相关蛋白Drp1和自噬相关蛋白p62的表达和活性的变化在缺血-缺氧诱导的氧化应激损伤中起着重要作用。

CIRI损伤是否改变了线粒体质量失衡的两个关键过程，即Drp1-medi化的线粒体裂变和p62介导的自噬通量，这两个过程之间是否存在内部核心关系，以及Drp1和p62如何参与调节CIRI的恶性循环尚不清楚。迄今为止，没有任何相关报告试图回答这些问题。

1.1  CIRI后，激活Drp1诱导线粒体过度裂变

a.脑血流散斑断层扫描。

b 大脑皮层的HE染。

c透射电镜图像显示CIRI后大脑皮层线粒体。各组线粒体长度和嵴密度的定量数据  

f.免疫荧光

1.2 ODG/R后，激活Drp1诱导线粒体过度裂变和ROS积累

g.共聚焦：线粒体形态   

h.细胞ROS   

i.线粒体ROS

CIRI和ODG/R后活化的Drp1诱导的线粒体裂变和ROS积累过多。

2.1  CIRI后，Drp1影响p62介导的自噬小体形成

 a. 免疫荧光图像显示CIRI和Mdivi-62治疗后p1和线粒体在大脑皮层中的共位。

b. LC3 II/I和CIRI和Mdivi-62处理后p1在总、细胞质和线粒体部分的蛋白表达。

c. 共聚焦图像显示 Drp3 shRNA 后 LC62、p5 和线粒体在 OGD/R 处理的 SH-SY1Y 细胞中的共位。

这些结果表明，CIRI诱导的Drp1激活可能增强线粒体中p62的释放，并加速CIRI后自噬体的形成。

2.2  ODG/R后，Drp1影响p62介导的自噬小体形成

d. LC3 II/I 和 p62 在 Drp5 shRNA 后 OGD/R 处理的 SH-SY1Y 细胞中总、细胞质和线粒体部分的蛋白表达。

e. 共聚焦图像

3.1  OGD/R后，ROS积累通过激活RIP1/RIP3通路阻断自噬体降解

a. 表明p62介导的自噬通量可能与DRP1诱导的ROS积累有关。

b. 结果表明，OGD/R诱导的ROS积累可能通过激活RIP1/RIP3途径阻断自噬通量。

3.2  激活Drp1通过RIP1/RIP3通路阻断自噬体降解

c. 蛋白质印迹分析。

d. 免疫荧光

e. 蛋白质印迹分析

这些结果证实，活化的Drp1诱导的ROS积累可能通过RIP1 / RIP3途径阻断自噬通量。

4.1  在CIRI和OGD/R后，电镜下没有观察到自噬体的大量积累，没有形成大量聚集体

a. 透射电镜图像显示CIRI后的膜性结构。

蓝色箭头：含有线粒体片段的自噬小体。

黑色箭头：疑似外泌体的膜性结构。

b. 共聚焦，蛋白凝聚物

由活化的Drp62诱导的未降解的p1标记的自噬体在CIRI和OGD / R之后通过外泌体分泌。 

4.2  在CIRI和OGD/R后，激活Drp1诱导分泌外泌体

这些结果表明，活化的Drp1增加了CIRI和OGD/R后外泌体中的含量。

综上所述，推测自噬通量被Drp62-ROS-RIP1/RIP1轴阻断后p3标记的自噬体缺乏大量积累可能是由于CIRI后含有大量未降解自噬体的外泌体分泌增加。

5.1  CIRI后，大量未降解的p62标记的自噬体以外泌体的形式被释放，含有p62标记的自噬体的外泌体加重了炎症反应

a.b.c. 结果证实了CIRI后大量未降解的p62标记的自噬体以外泌体的形式释放。

d. 结果表明，CIRI衍生的外泌体，而不是正常来源的外泌体，可以显着增加正常SH-SY1Y细胞中的TNF-α和IL-5β水平，表明含有未降解自噬体的外泌体可能在CIRI后加重炎症。

5.2  CIRI后，含有p62标记的自噬体的外泌体，进一步刺激RIP1/RIP3通路来阻断的自噬体降解

e. 用CIRI衍生的外泌体刺激正常和OGD / R处理的SH-SY5Y细胞可以在一定程度上进一步激活RIP1 / RIP3途径。

f. CIRI介导的外泌体对自噬体降解的阻断作用也可能被RIP1 / RIP1抑制剂Nec3以剂量依赖性方式抑制。

这些结果表明，CIRI后外泌体刺激的炎症因子可能通过RIP1/RIP3途径进一步阻断自噬体降解，引发病理生理恶性循环。

CIRI激活Drp1，加速p62介导的自噬小体的形成，同时通过RIP1/RIP3通路的激活，抑制自噬小体向自噬溶酶体的转变。

未降解的自噬小体以外泌体的形式分泌在细胞外，导致炎症级联反应，进一步损伤线粒体，导致ROS产生过多，自噬小体降解受阻，引发恶性循环。

创新点：

阐明了CIRI后，激活Drp1通过RIP1/RIP3通路加速自噬小体的形成，并阻断自噬体降解。并发现自噬体降解受阻后，能以外泌体的形式分泌，导致炎症级联反应，形成恶性循环。系统地剖析了CIRI后的病理生理恶性循环。

提示，通过调节RIP1/RIP3通路来加速p62自噬体转化和清除受损的线粒体，以及维持线粒体质量平衡和重建线粒体ROS积累，可能是改善CIRI病理生理的有效措施。

局限性：

1.使用OGD/r处理的SH-SY5Y细胞模型；是否也适用于其他脑组织细胞系，如BV2和CIRI临床样本，还需要进一步验证。

2.除了经典的p62介导的线粒体自噬途径外，其他lc3结合受体，如BNIP3、FUNDC1和FKBP8，是否也可能参与CIRI后drp1调控的自噬流，值得进一步研究。

3.由于目前外泌体检测方法的局限性，没有高时间和空间分辨率特异性成像，目前我们只能使用外泌体标记蛋白结合光学成像技术进行定位分析。在未来，需要在单细胞和单外泌体水平上进行更准确的动态研究。

4.在实际情况下，脑缺血-再灌注通常发生在被凝块阻断的脑血血流中，并被组织型纤溶酶原激活物（t-PA）恢复。血凝块或t-PA如何影响本研究的结论需要在临床试验中进一步研究。