收藏 | 非酒精性脂肪肝模型构建操作方法汇总

1. 高脂饮食(Highfatdiet，HFD)模型

HFD是最基础的非酒精性脂肪肝病造模方式，此模型大致模拟了西方日粮。HFD中含有较多的脂肪合成原料，可促进肝脏脂肪生成，过度堆积脂肪，从而导致脂肪肝。

C57BL/6小鼠由于对高脂饲料比较敏感，容易形成高脂血症，故而是常用的复制NASH模型的动物。

长期喂食HFD后，动物主要会出现肥胖、IR、单纯脂肪变性等症状。常见的HFD包含71％脂肪、11％碳水化合物和18％蛋白质。

HFD炎症严重程度与处理时间成正比，目前对于非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型，大部分研究的HFD诱导时长为12～20周。

喂食高脂饮食的小鼠模型模拟了人类NAFLD的组织病理学和发病机制，因为它具有NAFLD患者中观察到的主要特征，包括肥胖和胰岛素抵抗。因此，该模型适于评估减重、低脂饮食及改善胰岛素抵抗的治疗药物。高脂饮食模型也有一定的局限性，如造模耗时较长，而且随着动物种系和饮食配方的不同呈现出多样性。

2. 致动脉粥样硬化饮食(ATH)模型

ATH含有0.5％胆酸盐和1.25％的胆固醇，通常应用于小鼠以构建粥样硬化斑块模型。

研究发现，ATH可致C57BL／6小鼠出现血脂异常。与此同时，在6－24w内，ATH还引发了NASH，且造模时间越长，病理状态越严重，如出现肝细胞大泡性脂肪性变，炎症以及肝纤维化等。此外，小鼠在6w后也表现出丙氨酸氨基转移酶、总胆固醇和甘油三酯水平升高。

然而，ATH并不致体重增加，也没有明显的胰岛素抵抗现象，因此，与人类NASH病理机制有一定区别，成为该模型的缺陷。

3. 高脂＋致动脉粥样硬化饮食(HFD＋ATH)模型

HFD＋ATH是在高脂饮食的基础上，添加0.5％的胆酸盐和1.25％的胆固醇。该模型结合了高脂模型及ATH模型的优点，可有效地促进非酒精性脂肪肝炎的进一步发展，主要病理特征为胰岛素抵抗、氧化应激、肝星状细胞激活。

相关研究表视将HFD＋ATH(60％脂肪＋1.25％胆固醇＋0.5％胆酸盐)与胆碱－蛋氨酸缺乏饮食进行分析比较，两者具有类似的NASH病理特征，HFD＋ATH诱导的C57BL／6小鼠表现出肝胆固醇和游离脂肪酸增加，而胆碱－蛋氨酸缺乏饮食的小鼠为肝脏的甘油三酯水平升高为主。

4. 高脂＋胆固醇饮食模型

高脂＋胆固醇饮食是在高脂饮食的基础上，添加21％的黄油和0．2％的胆固醇。

短期喂养高脂＋胆固醇饮食后，C57BL／6J小鼠仅发生肝脏脂肪变性。而雌性ldlr－/－和APOE2ki小鼠会表现出严重的炎症和脂肪变性，其特征为巨噬细胞浸润和NF－kappaB介导的信号增强。雄性ldlr－／－和APOE2ki小鼠也出现严重的肝脏炎症，但未有脂肪变性。

此外，一种西方饮食，其中有富含n－6－PUFA大豆油(100g大豆油含有25g的n－6－多不饱和脂肪酸)和0.75％胆固醇。C57BL／6小鼠被给予该饮食20w后，小鼠表现出肝脂肪变性呈气球样变、氧化应激、炎性细胞浸润、Kupffer激活和肝纤维化，伴有体重增加、胰岛素抵抗的NAFLD特征。

5. 高脂＋高糖饮食(ALIOS)模型

ALIOS是一种高脂与高糖饮食协同诱导的小鼠模型，ALIOS造模方法是高脂饲料(含30％的反式脂肪酸)及果葡糖浆喂养，16w后，C57BL／6小鼠有明显的脂肪变性，伴有坏死性炎症，丙氨酸转氨酶水平升高。

与仅高脂饲料(含30％的反式脂肪酸)喂养相比，ALIOS组动物体重明显增加，食物摄入量增加，胰岛素抵抗增强，但脂肪变性程度和丙氨酸转氨酶水平几乎无变化。

有文献报道，通过使用西方饮食(Tekladdiets，TD．120528)饲料，辅以高果糖的饮用水，两周一次腹腔注射小剂量的CCl4时，发现C57BL／6小鼠可快速地从单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎，肝纤维和肝细胞癌的演进，几乎符合人类NAFLD的病理过程。

6.  高脂＋高果糖＋高胆固醇饮食(AMLN，GAN)模型

为了弥补先前报道的ALIOS小鼠模型的缺陷，更加客观评估动物肝脏病理进程，可通过高脂＋高果糖＋高胆固醇(AMLN)饮食模型，其含40％的脂肪(其中约18％的反式脂肪酸)，22％的果糖和2％的胆固醇。

C57BL／6和ob／ob小鼠同时喂养AMLN(26－30w)后，均出现明显的肝脂肪变性、肝小叶炎性细胞浸润和肝细胞形态肿胀。

值得注意的是，C57BL／6小鼠需喂养26－30w后，才会出现上述病理特征。相比于C57BL／6小鼠，ob／ob小鼠喂养AMLN12w后，则可表现出甘油三酯和丙氨酸氨基转移酶水平明显升高。

另外一种含有41％的脂肪，30％的果糖和2％的胆固醇的高脂＋高胆固醇＋高果糖饮食可很好地模拟西方饮食中高脂高糖高胆固醇的习惯，该饮食模型适用性更为广泛，已被用于建立多种基因型小鼠的非酒精性脂肪肝炎模型。

研究报道，相关研究提出了GAN饮食模型，配方含40％的脂肪    (无反式脂肪酸)，22％的果糖，10％蔗糖和2％的胆固醇。ob／ob小鼠喂养GAN8－16w后，表现出明显的体重增加，且与人类NASH的病理特征十分相似。此外，与AMLN饮食的ob／ob小鼠的病理特征也具有一致性，但GAN饮食的ob／ob小鼠的体重增加更为明显。

相比之下，C57BL／6小鼠则需要较长的喂养时间(通常需要28w后)才能诱导出与上述一致的NASH模型。

7.  胆碱－蛋氨酸缺乏饮食(MCD)模型

胆碱－蛋氨酸缺乏饮食含40％的蔗糖和10％的脂肪，但是不含有蛋氨酸和胆碱。最初2－4w内小鼠就会出现NAFLD病理表型的主要特征，如小鼠的肝细胞大泡性脂肪性变，并随后出现明显的纤维化。

尽管MCD模型是研究NASH的重要工具，并用于早期药物的筛选，但MCD模型也有一定的局限性，如胆碱－蛋氨酸缺乏饮食配制繁琐，不符合人类饮食规律，也与人类NASH患者的实际代谢状况完全不同，缺乏人类NASH所具有的全身性胰岛素抵抗特征。

相关研究发现MCD模型呈现出低血清胰岛素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯水平。与NASH患者多有肥胖不同，MCD模型较正常对照组出现严重体重下降，呈恶病质状态。

8.  胆碱缺乏L－氨基酸饮食(CDAA)模型

CDAA饮食含有68．5％的碳水化合物、17．4％的蛋白质和14％的脂肪。CDAA饮食诱导模型与MCD小鼠模型类似，它可以抑制肝细胞的脂肪酸氧化，增加脂质合成，氧化应激和炎症，最终导致纤维化。

长期喂食CDAA的小鼠也可出现体重增加、胰岛素抵抗和血脂水平显著升高。另外，CDAA喂养小鼠出现代谢相关症状的时间长，目前仅限于肝脏疾病研究，不宜单独应用于NASH相关研究。

非酒精性脂肪肝病营养失调性C57BL/6小鼠模型

1. 链脲佐菌素(STZ)诱导模型

链脲佐菌素诱导模型常见于诱导2型糖尿病的实验性模型，C57BL／6小鼠在出生2d后，给予200μg／L剂量，并结合高脂饮食喂养，大约20w内出现脂肪性肝炎、纤维化甚至肝癌，可以作为NAFLD的小鼠模型。

STZ诱导模型小鼠6周龄出现单纯性肝脏脂肪变性，8w时出现小叶炎症和肝细胞广泛气球样变，8－12w时肝脏脂肪沉积向纤维化发展，20w时小鼠高发肝细胞癌。造模期间，小鼠的转氨酶和血糖浓度一直呈现升高趋势。

该模型可以诱发氧化应激、炎症、纤维化和肝细胞凋亡，符合NAFLD的组织病理学。但与人类NAFLD的胰岛素抵抗不同的是，链脲佐菌素会破坏胰岛β细胞功能，而不会导致全身性的胰岛素抵抗。

因此，这也限制该模型在临床前药物研究中的使用。

2．四氯化碳(CCl4)诱导模型

CCl4单独诱导模型仅出现肝纤维化，而不发生肥胖和胰岛素抵抗等病变，因此不属于NAFLD模型。

因此，CCl4通常需要与饮食诱导模型相结合制备NASH模型，如CCl4可以促进高脂饮食对非酒精性脂肪肝炎和肝纤维化的发展。

非酒精性脂肪肝病药物毒性诱导C57BL/6小鼠模型

ob／ob和db／db

肥胖基因（OB）所表达的瘦素通过影响新陈代谢和食欲来调节体重和脂肪沉积，其含量与脂肪沉积程度成反比，瘦素受体是由糖尿病相关基因（db基因）编码产生的蛋白质，DB基因所编码的瘦素受体缺失容易引起高血糖症或IR。

ob／ob或db/db小鼠先存在隐性突变，先天缺少显性OB或DB基因，无法编码瘦素或瘦素受体，其特征是肝脏脂质积累增多，不自发产生炎症和纤维化，表现出脂肪肝的明显代谢特征，是脂肪肝的良好遗传模型，两者不同之处在于，ob／ob小鼠可以抵抗肝纤维化，而db/db小鼠却不抵抗肝纤维化。

然而，先天性瘦素缺乏或基因突变引起的瘦素抵抗在肥胖或NASH患者中并不普遍，因此ob／ob和db/db小鼠模型在反映动物肥胖或NASH的成因方面能力有限。

非酒精性脂肪肝病基因缺陷模型

基因编辑模型无法独立发展为脂肪肝，因此许多动物模型结合自然发生的基因突变或靶向基因修饰与日粮诱导两种方法，使模型的组织病理学和病理生理学更接近于动物脂肪肝。

例如：

① 对Foz/foz雌性小鼠饲喂含0.0、0.2或２.0％（w/w）胆固醇的HFD12或24周，结果发现胆固醇喂养的小鼠肝脏胆固醇含量和ALT水平成正比，表明游离胆固醇积累的增加与脂肪肝进展相关，且此混合模型更能模仿人类的脂肪肝状况。

② 通过给８～１２周龄ob/ob和db/db小鼠饲喂MCD日粮（10％脂肪、40％蔗糖、缺乏蛋氨酸和胆碱），４周后观察到肝脏中的脂肪浸润严重，硫代巴比妥酸反应物水平和亚硝酸盐的增加，且db/db小鼠比ob/ob和野生型小鼠有明显更高的血清ALT水平和更严重的肝脏炎症和纤维化。由于肝组织的脂肪变性和氧化应激密切相关，这些变化可能促进了动物的NASH。

也有研究对ｄdb/db小鼠饲喂高铁元素日粮，观察到日粮中的铁超载可以加速动物脂肪肝向NASH的发展进程。

③ 有研究对30周龄OLETF大鼠饲喂含６０％果糖的ＨＦ日粮，发现其产生了血脂异常和炎症等症状，BiP、ｐ-IRE1α和t-IRE1α蛋白表达量显著增加，表明内质网应激通路被激活。

非酒精性脂肪肝病复合模型

研究者应根据实验研究目的，选择符合人类脂肪肝形成过程及病变特征、造模时间短、动物死亡率低、重复性好、操作方法较简便的动物模型进行研究。