【5分钟讲透实验】影响WB实验结果的因素综述

WB实验作为分子生物学中最为常见的实验，却蕴含了很多技巧与知识，那要怎样才能做出漂亮的WB检测结果呢？

1. 蛋白质的样品制备注意以下问题：

（1）在合适的条件下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

（2）选择合适的表面活性剂和还原剂，使其形成各自多肽的溶液。

（3）尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，裂解完毕离心之后取中层澄清溶液时避免吸到底层沉淀和上层脂类。

（4）整个制作蛋白样本的制备过程必须在低温下进行，避免细胞破碎释放出各种酶类，但是注意不要反复冻融。

（5）所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的pH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2. 细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？

一般5×10⁶就足够。

3. 小分子量蛋白10KD需要的注意点

1）可选择孔径0.22μm的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；

2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移，其他按步骤即可。

4. 大分子量蛋白200KD需要的注意点：

（1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；

（2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）；

（3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高。

制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED至开始凝胶，时间为10—20分钟(未完全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8-10min，可通过控制AP和TEMED量来控制。

1. 凝胶质量

不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的pH值应在8.8左右，而浓缩胶的pH应在6.8左右，最好不要差过0.5个pH单位，因为这个pH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的pH值是否稳定是很重要的。

2. 在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象？

（1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行；

（2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的；

（3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象；

（4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下。

1. 点样

样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液pH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的pH值，进而影响浓缩效果。

因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。

2. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量

可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。

（1）应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀，否则条带容易中间凹陷两边翘起。

（2）两板玻璃之间排除所有的气泡，防止条带中间鼓两边下陷。

（3）加样前离心，选择适当的样本缓冲液（尽量用新鲜配制的，这样能保证pH值和离子强度的稳定），加适量的样品促溶剂，防止wb条带拖尾或蛋白出现纹理。

（4）常用浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。

膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑：

（1）要使western blot蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的pH值很重要。分子量不是很大的蛋白质区带要适当改变转移缓冲液的pH，而分子量较小的蛋白质，可以在缓冲液中加入适量甲醇促进它们固定在固相膜上（大分子量的蛋白质不适合加甲醇）。

（2）电转印膜常用的NC膜使用的最为普谝，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价性的，膜干燥后很脆。操作过程中要注意。

（3）如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。

（1）蛋白质免疫印迹电泳转膜过后，为防止与一抗或二抗非特异性结合，膜上其他没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭。

（2）封闭液中加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果。

封闭液的选用要求：

（1）常用封闭液为脱脂牛奶（GBCBIO-232100）、牛血清白蛋白（BSA GBCBIO-0332）、无蛋白封闭液（GBCBIO-G7205）等

（2) 封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时

（3) 封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7

注：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。

（1）适当降低抗体的浓度，增加洗膜次数防止非特异性条带过多；

（2）优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当延长曝光时间，防止信号弱、可能转膜不完全；

（3）一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；

（4）二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。

2. WB中抗体的可以重复应用吗

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

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