帕金森疾病

时间:2020-12-25浏览次数:581

      帕金森病(Parkinson disease, PD)是中老年常见的基底节神经元进行性退行性疾病,主要累及黑质和纹状体多巴胺递质系统。6-胫基多巴胺(6-0HDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是两种主要的多巴胺能神经毒性物质,可以很好的模拟PD患者的临床表现和病理改变。由于6-OHDA不能通过血脑屏障,需立体定向注入脑内,目前多采用黑质致密部(SNc)、纹状体(cs)、中脑腹侧被盖区(VTA)、前脑内侧束(MFB)等部位进行注射;MPTP有高度的亲脂性,易通过血脑屏障,选择性浓集于黑质,通常经腹腔或皮下注射。


实验步骤:

      1.6-OHDA致大鼠PD模型的制作:

      (1)SD大鼠称重,按每笼5-6只饲养。在实验设计的时间点,将大鼠以1%戊巴比妥钠麻醉,待动物失去知觉即可开始操作。

      (2)大鼠用立体定位仪将双耳及门齿固定。自矢状缝皮肤划开,棉球止血,定位,钻孔,挑破脑膜(以黑质致密部单侧损毁为例,参照Paxinos图谱确定注射坐标,前颅后5.2mm,左侧或右侧旁开2.2mm,进针深7.8mm)。

      (3)微量注射器注射,以浓度2µg/µL,注射速度1µL/min注射,并留针10min,以1mm/min的速度退针。止血,缝合伤口。在实验动物苏醒的过程中,注意保温,观察各项生命体征。156第四章,神经系统疾病常用动物模型的制作在手术后的数周内,观察动物的进食、体重、行为学变化等情况。单侧损毁的方法,技术上比较成熟,操作较易、死亡率低,模型相对稳定,易区分双侧肢体运动细小异常,能对比患侧黑质的手术前后及与正常侧表现。双侧毁损是较大范围神经化学和行为学损伤,更似人类PD。但对基底节下丘脑等特殊区域损伤较大,死亡率很高,且操作较繁琐,目前PD实验研究中较少应用。


      2.MPTP致小鼠PD模型的制作:

      C57/BL小鼠称重,每笼5-6只左右。戴手套将小队的头颈部、尾部固定,经腹腔或皮下注射,单次注射的剂瞿为20-30mg/kg。根据实验要求和目的,可分为快速模型和慢速模型。快速模型可分为单次注射和多次注射。单次注射的剂最为30mg/kg,该模型损伤轻,易恢复;多次注射的剂量为20mg/kg,每隔2h注射1次,共3-4次,该模型损伤快且严重,DA神经元的损伤到死亡可以在3d内完成。慢速模型需多次注射,每天1次,单次注射的剂量为20mg/kg,连续注射5-7d。该模型的成活率较高,实验周期较长。


结果判定:

       PD模型可通过体重检测、旋转杆实验、旷场实验、悬挂测试等进行评价。黑质多巴胺神经元的损伤程度可通过阿扑吗啡(或苯丙胺)引发的向健侧(或伤侧)旋转运动来较好地评估。与对照组相比,成功的模型组会出现明显的体重增加缓慢、自主活动减少等特点。另外,通过免疫组化或分子生物学的方法观察黑质、纹状体等部位的TH表达的明显减少也是判定PD模型成功与否的一个金标准。


注意事项:

       1.MPTP有剧毒,在称量溶解和注射时一定做好个人的防护工作;MPTP、6-OHDA等试剂现用现配。

       2实验分组及动物较多,一定要做好标记,以免混淆,造成实验失败。

       3.SD大鼠在造模后,一定注意保温、吸痰。根据大鼠的夜间习性,下午或晚上造模的成活率更高些。

       4.小鼠应激反应较强,抓取时应带厚的手套,以免被咬到。

       5.小鼠在注射MPTP后30min内会出现颤抖、口角抽揣、肢体平衡能力差等一系列行为学的改变,可能是MPTP对肾脏、肝脏等器官产生的毒害作用引起的一些生理指标,如血压、体温和肝功能等的变化。因此,应在MPTP最后一次注射后第3天或第4天以后再进行行为学测试,更能客观地检测小鼠PD模型的行为学变化。

       6.6-OHDA致PD模型定位注射时注射速度宜缓慢,过快可导致注射范围扩散;微量注射器选择时避免注射针头过粗造成损毁区域增大。

       7.进行行为学实验时,尽星避免外界环境(嘈杂、强光等)的干扰。



其他:

       造模的成功与否,决定了进行各相关指标检测结果质址的好坏。制备PD模型选取时需综合考虑造模目的和用途、靶点的位置(SN,CS、vTA、MFB)、药物剂量多少和浸润范围大小、损伤的程度(部分、完全)、动物的安全性(死亡率)和有效性(成功率)、操作难易性、精确性和稳定性等等。因此,在两模型具体应用时要有所选择:

       ①根据药物特性选择建模方法6-OHDA需立体定向注入靶位、MPTP经腹腔或皮下注射;

       ②根据药物敏感性选择动物大鼠对6-OHDA敏感,制备模型时按前述因素综合考虑,灵长类对MPTP最敏感但受限制,而常用小鼠;

       ③根据应用目的和用途选择模型6-OHDA注射靶位选取灵活,注射剂量可调,动物行为变化稳定可靠,检测量化性好,多用于PD的临床前药物研究和药理疗效判定、神经保护、细胞移植和基因治疗等方面的研究,MPTP用药方案多样,诱导产生的症状及病理、生化改变方面与人类PD更相似,主要用于PD病因、发病机制,药物毒理试验等研究。



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