细胞外泌体摄取实验方案（DiD荧光标记）——基于膜融合示踪技术的实验流程

1. 核心原理

采用DiD（DiIC18(5)-DS，CAS 127274-91-3）脂溶性荧光探针标记外泌体膜结构。该探针具有以下特性：

• 膜特异性：通过疏水作用嵌入脂质双分子层（激发/发射波长644/663 nm）。

• 环境敏感型荧光：标记后量子产率提升20倍（从水相0.01至膜结合态0.21）。 

• 低毒性：工作浓度下细胞存活率>95%（MTT法验证）。

  
  

2. 关键设计进

• 外泌体质量控制：增加NTA粒径分析（80-150 nm）、TEM形态学验证、Western blot检测CD63/TSG101/Alix标志物。

• 标记效率量化：通过荧光分光光度计测定DiD标记外泌体的荧光强度（Ex/Em=644/663 nm），计算标记效率（μg DiD/mg外泌体蛋白）。

• 动态监测优化：引入活细胞动态成像系统（37℃, 5% CO₂维持），实现时间分辨率达5分钟级的实时观测。

1. 生物材料

• 细胞系：人源肿瘤细胞（如MCF-7）、原代巨噬细胞（BMDM）。

• 外泌体来源：超速离心法（100,000×g, 4℃, 70 min）联合密度梯度离心纯化。

  
  

2. 试剂系统

3. 仪器配置

• 超分辨共聚焦显微镜（Nikon A1R HD25，配备60×油镜）。

• 活细胞成像系统（PerkinElmer Opera Phenix）。

• 超速离心机（Beckman Coulter Optima XPN-100）。

1. 外泌体标记与表征

① 标记反应体系：

外泌体悬液（100 μg蛋白） + DiD母液（终浓度5 μM） → 37℃避光震荡孵育4 h（转速200 rpm） → 超速离心（120,000×g, 4℃, 90 min）去除游离染料 → 过PD-10脱盐柱（Cytiva）进一步纯化。

② 质量控制：

• BCA法测定蛋白浓度（标记后回收率≥80%）。

• ZetaView纳米颗粒分析仪检测粒径分布（PDI<0.2）。

• 荧光强度标准化：以BSA-DiD标准曲线校准。

  
  

2. 细胞处理与摄取实验

      ① 细胞铺板：

• 共聚焦专用培养皿（MatTek P35G-1.5-14-C）。

• 接种密度：5×10⁴ cells/cm²（依细胞类型调整）。

• 贴壁时间：16 h（确保细胞处于对数生长期）。




② 外泌体摄取：

• 无血清培养基稀释DiD-外泌体至工作浓度（梯度设置：10-200 μg/mL）。

• 37℃共孵育时间梯度（0-24 h，间隔2 h动态监测）。

•  竞争抑制对照：添加肝素（10 μg/mL）阻断网格蛋白通路。




③ 样本固定与染色：

• 4% PFA固定15 min → 0.1% Triton X-100透膜5 min。

• Hoechst 33342染色（5 μg/mL, 10 min）。

• 抗淬灭封片：ProLong™ Diamond封片剂 。

  
  

3. 图像采集与定量分析

① 显微成像参数：

• DiD通道：640 nm激光（5%功率），700-750 nm发射滤片

• DAPI通道：405 nm激光（2%功率），425-475 nm发射滤片。

• Z-stack扫描（步距0.5 μm），3D重构消除焦点漂移

1. 标记特异性验证：

阴性对照：未标记外泌体 + 游离DiD染料。

阳性对照：DiI标记外泌体（激发/发射549/565 nm）。

2. 动态范围优化：

确定线性检测范围：外泌体浓度与荧光强度R²>0.98

光漂白校正：Time-lapse成像时添加抗淬灭剂（如Oxyrase）。

3. 膜完整性检测：

透射电镜验证：标记后外泌体膜结构完整。

Annexin V-FITC共染：检测膜磷脂酰丝氨酸外翻率<5%。

1. 摄取通路解析：

• 网格蛋白抑制剂（Pitstop 2，终浓度30 μM）。

• 小窝蛋白抑制剂（Filipin III，终浓度1 μg/mL）。

• 巨胞饮抑制剂（EIPA，终浓度50 μM）。