【神经系统疾病模型】帕金森（PD）动物模型构建
时间：2023-07-03 阅读：487帕金森病(PD)是常见于中老年人群的神经退行性疾病,患病率随年龄增加逐步增高,大约有1%的60岁以上的人受到PD的影响,80岁以上人群患病率约为3%,相关研究数据显示,我国PD患者高达1.7%,PD其他相关疾病的发病率也随着年龄的增长而增加。
PD主要病因是黑质-纹状体内以多巴胺(dopamine,DA)合成减少,神经生化发生改变,多巴胺能神经元变性坏死会导致脑内多巴胺含量显著减少。
目前PD动物模型主要为三类:神经毒素模型(如:MPTP、6-OHDA、鱼藤酮、百草枯等)、转基因模型(如:parkin、PINK1和DJ-1)及以上二者联用模型。
常用PD模型造模方法对比
PD模型在一定程度上再现了其主要病理生理特征,包括黑质致密部(SNc)DA能神经元进行性丢失、路易小体(LB)形成和运动缺陷等。
1. 黑质致密部多巴胺能神经元进行性丧失：
黑质致密部（SNc）是大脑中的一个区域，其中存在着多巴胺能神经元。在帕金森病中，这些多巴胺能神经元会逐渐丧失，导致多巴胺水平下降。多巴胺是一种重要的神经递质，负责调节动作控制和运动协调。因此，多巴胺能神经元的丧失会导致运动功能障碍和其他相关症状。
2. 路易小体的形成：
路易小体（Lewy body, LB）是帕金森病的典型病理学标志，是由蛋白质α-胡椒肽（α-synuclein）聚集而成的圆形或椭圆形结构。这种异常聚集的α-胡椒肽会在多巴胺能神经元内形成小体，影响细胞功能。路易小体主要存在于黑质致密部的多巴胺能神经元和其他脑区域，其累积与神经元损伤和帕金森病的发展有关。
3. 运动缺陷：
帕金森病的主要临床表现是运动缺陷，包括静止性震颤、肌强直（肌肉僵硬）、动作迟缓（运动减少）和姿势平衡障碍等。这些症状主要源自黑质致密部多巴胺能神经元的丧失和多巴胺水平的减少。多巴胺能神经元的丧失导致了大脑中运动控制回路的异常功能，从而造成运动缺陷和协调障碍。
除了上述特征之外，帕金森病还可能伴随其他非运动症状，如认知障碍、抑郁、睡眠障碍和自主神经功能紊乱等。这些症状可能与多巴胺以外的神经递质系统的改变以及其他神经系统结构的受累有关。
帕金森病动物模型通常涉及多个机制通路，其中包括线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等。
具体的机制通路可能因不同的动物模型而有所差异，这些模型在研究帕金森病的病理生理机制、疾病进展以及治疗策略等方面起到了重要作用。
PD动物模型中应用的多巴胺能神经毒素分子及其细胞内途径的示意图如下：
MPTP(黑色囊泡)系统给药后穿过血脑屏障进入大脑，经胶质细胞摄取后被单胺氧化酶(MAO-B)氧化为MPP+(蓝色囊泡)释放到细胞间隙，再经多巴胺转运体(DAT)进入到多巴胺能神经元，作用于线粒体呼吸链复合酶I；6-OHDA直接注射到大脑，经多巴胺转运体(DAT)进入到多巴胺能神经元，作用于线粒体呼吸链复合酶I。
1. 动物
SPF级C57BL/6健康小鼠，50只，雄性，8周龄，体质量（25±2）g，小鼠适应性喂养1周，自由进食、饮水，室温（23±2）℃，相对湿度（55±10）%，光照、黑夜12h循环，小鼠自由饮水、饮食。
2. 分组与造模
50只C57BL/6小鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为正常组，其余40只小鼠采用MPTP腹腔注射法制PD模型。
造模方法：将MPTP溶于无菌生理盐水中，按25mg/kg剂量腹腔注射，并联合使用丙磺舒（250mg/kg）延缓MPTP代谢清除，每周2次，连续5周，总计注射10次。非造模动物给予等体积0.9%NaCl溶液灌胃处理，持续5周。
模型复制成功后，采用随机数字表将40只小鼠分成模型组、六味地黄汤组、金匮肾气汤组、芪脊舒僵汤组。
因MPTP注射后小鼠僵直症状在数小时后逐渐恢复正常，为了研究中药方剂对帕金森病小鼠僵直症状的影响，因此在中药干预两周结束后的第1d，采用15mg/kg的小剂量MPTP对小鼠进行腹腔注射，以诱发僵直症状的出现。
3. 干预方法
六味地黄汤、金匮肾气汤的组成与剂量均按照《方剂学》进行配伍。按照人与动物千克体质量折算的等效剂量换算方法换算小鼠每日灌胃剂量，按照换算药物剂量的6倍，计算3种药物灌胃剂量，分别为：芪脊舒僵汤：153.12g·（kg·d）-1、六味地黄汤：67.58g·（kg·d）-1、金匮肾气汤：73g·（kg·d）-1，按照小鼠体质量计算灌胃剂量，同时正常组与模型组均予以0.9%NaCl溶液灌胃，每天1次，连续灌胃2周。
4. 模型评价与检测
行为学检测：爬杆实验、僵直评分测试；
ELISA 法检测各组小鼠目标蛋白含量；
WB检测TH蛋白表达水平；
免疫组化：小鼠黑质层面阳性 TH+多巴胺能神经元细胞。
1. 实验动物与分组
选取雄性C57BL/6J小鼠，9~10月龄，体质量28~35g，动物饲养于SPF级动物实验室，高压灭菌饮用水和饲料，动物自由摄取。将动物随机分为假手术组（Sham组）和6-OHDA组，每组15只小鼠。
2. 实验方法
6-OHDA纹状体立体定位注射建立PD模型将小鼠置于吸入式麻醉诱导盒中，将异戊烷浓度升至2%行诱导麻醉。待小鼠充分麻醉后，将小鼠头部连接麻醉面罩，调整异戊烷浓度至1%维持麻醉。将动物固定在立体定位仪上，沿头部矢状线做1.3cm长的切口，用3%H2O2消化颅骨表面的软组织，暴露前囟。
以中线旁−2mm、前囟前+0.5mm为进针点，用颅骨钻在颅骨表面打直径约为1mm的小孔。微量进样器（10μL）缓慢下行，在颅骨下3.5mm注入药物（6-OHDA组注入含有1%抗坏血酸的6-OHDA溶解液1.2μL，Sham组注入含有1%抗坏血酸的生理盐水），速度0.5μL/min，每次注射完成后需留针5min。缓慢退出进样器，处理创面。
3. 模型评价与检测
行为学检测：旋转实验、转棒实验；
WB检测脑组织中 TH蛋白含量；
免疫组化观察细胞衰老；
RT-qPCR 检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKi）及衰老相关分泌表型（SASP）。
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