动物行为学实验方法及评分方法

动物行为实验由于是动物整体生理和心理状态综合、全面和实时效应的反应，被认为是人类疾病表现和发病机制研究，新药发现、安全和风险监测分析的基本实验手段，在医学、药学、生命科学和军事医学等研究领域具有不可替代的地位和作用，越来越受到国际科学界的广泛重视。

动物行为实验方法(experimental methodology based on animal behavior research)是动物行为学的重要内容，是融合动物学、医学、药学、生物学、电子工程、计算机和信息等多学科的基础理论、技术和方法，以正常和(或)实验动物为对象，在自然界或实验室内，以观察和实验方式对动物的行为信息进行采集、分析和处理，将其实验结果类比和推演到人，研究其行为信息的生理和病理意义的新兴学科。

接下来主要从模型评价实验方法和评分方法两个方面进行详细的说明。

1、学习及记忆能力

学习记忆功能异常是绝大多数神经系统疾病的临床特征，如阿尔茨海默症，帕金森病，癫痫，精神分裂，脑瘫，脑卒中等。

学习是神经系统接受外界环境变化获得新行为和经验的过程，记忆是指对学习获得的经验或行为的保持，包括获得、巩固、再现及再巩固四个环节。学习和记忆二者是互相联系的神经活动过程。可用来评估小鼠的学习能力、记忆能力，可通过横向、纵向比较获得不同变量影响下或不同时期的小鼠学习记忆能力。

① Morris 水迷宫实验：通过测定不同入水点下实验动物寻找并爬上平台所需要的时间，是一种评价拟痴呆动物模型的理想方法，用于评价动物的学习和记忆能力。

② 空间搜索实验：依次从一、二、三象限入水点将动物放入水中，分别 3 次记录动物 90 s 内在目标象限的游泳时间（第四象限），有效区停留时间、经过站台次数、经过有效区次数。多用于反应动物对事物记忆的保持能力。

③ 探孔实验：将实验动物放于探孔板（4×4 排列）的中心，记录实验动物在 3、4、5 min 时将头深入探孔中的次数。为评价实验动物基本探索能力的检测。又称洞板实验，是基于小鼠具有探洞的天性，从而评价其对新环境的探索能力。随着时间的延长及反复进入洞板仪次数的增多探洞次数明显减少，从而产生适应性的特点，洞板实验也曾被一些学者应用于评价对于小鼠的记忆力。

④ 跳台实验：给予箱底连续 5 min 的交流电刺激，记录每只大鼠收到电击后跳上平台的次数，此为正常的躲避伤害性刺激的反应。将大鼠跳上平台的次数作为学习成绩。24 h 后重新实验，在通电的情况下，直接将大鼠置于平台上，记录其第一次跳下平台的潜伏期和 5 min 内的错误次数作为记忆的成绩。常用于评价实验动物的记忆能力。

⑤ Y 形迷宫实验：给予温和的足部电击，行为反应为动物逃避曾经遭受过电击刺激的地方，以每只大鼠受到电击的次数作为学习成绩，24 h 后重新测试时的潜伏期和错误次数则作为记忆的成绩。能够简便的对学习记忆能力进行评价。

⑥ 被动回避实验：第 1 天将动物放入有照明的箱内，实验动物会通过小门进入暗箱，让其滞留于暗箱中 30 s 后放回笼中。第 2 天同第 1 天，但是待其在暗箱中时，给予足底电击，持续 1.5 s 后取出动物。第 3 天时记录动物从照明箱进入暗箱的延迟时间。延迟的时间越长，代表其学习能力越好。

2、耐力及运动能力

运动功能检测是实验动物行为学检测的重要内容。动物的每一种行为学检测方法都需要动物进行运动。另外，运动功能障碍也是帕金森病、脑缺血等中枢神经系统疾病的主要临床表现。

运动行为实验方法包括：

（1）一般运动行为学评价，如旷场实验；

（2）协调运动评价如滚轴、平衡木实验等；

（3）肌力评价如握力实验；

（4）耐力行为学评价，如负重游泳、跑台实验等。

① 转棒实验：实验动物在转棒仪器上以4 r/min的速度适应 10 min 后，休息 30 min，以匀速 10 min 内4~40 r/min，记录实验动物掉下的速度和转棒上保持的时间，用于评价实验动物的运动能力。

② 采用踏步实验：实验动物沿着栅格移动时，前肢或后肢踩空，记录为一次错误。正常的实验动物，精细运动能力较好，踩空次数较少。而在缺血中风模型实验动物中，踩空次数发生较多。检测时，动物从一端放入，记录 100 步所用时间、发生错误次数。

③ 跑步机实验：将小鼠置于动物用跑步机上，在跑步机后部给予电击。如果动物在后方点击区域的停留时间超过 4 s，反应为动物力竭。记录动物跑动的最长时间及受电击次数。动物耐力用单位时间内受电击的次数表示。

3、协调能力

① 平衡棒实验：采用两个平行棒（直径 1 cm，长115 cm，间距 2.5 cm），末端与平台（15 cm×50 cm）相连接，记录双后肢位于平行杠上的时间，一侧后肢掉下或者摔倒、摇摆等情况。记录每分钟每米的错误次数。用于评价实验动物后肢的协调能力。

② 爬杆实验：将小鼠放在棒的顶端，头部向下，使小鼠自然向下爬行。分级标准如下：

0 级：一步步向下爬；

1 级：向下滑行；

2 级：不能抓住棒；

3 级：翻正反射消失。则是用于评价实验动物协调性的实验。

4、自发活动能力

① 旷场实验：将实验动物放入25 cm×25 cm×25 cm 的空箱，与旷场中央放入单只实验动物，予自由活动 10 min。试验后喷洒酒精消除味道，进行下一只动物的实验。分析实验动物在中央区域和周边区域的活动距离和时间。用于评价实验动物自发活动情况。

② 高架十字迷宫实验：由两条开臂和两条闭臂组成，呈相互垂直“十”字形，实验动物头朝开臂，放入其中，予自由活动 5 min，分析小鼠进入开臂和闭臂的时间及次数。用于评价实验动物对于新奇环境的焦虑反应。

③ Lat 实验：为给予大鼠一个视觉空间注意目标，分别记录大鼠穿越角落的频数（自发活动水平），直立和斜搭在墙上的频率（非选择性注意的水平）。Lat 迷宫实验在大鼠自发活动及非选择性注意水平的评价中可靠性非常高，已经成为有关注意缺陷疾病的常用模型之一。

5、动物情志活动能力

由于动物的情绪体验难以用语言表达，行为实验是其主要的评价方法。实验方法主要包括强迫游泳、悬尾、糖水偏爱、获得性无助、高架十字迷宫、旷场、明暗箱实验等

① 糖水摄取实验：对大鼠进行 24 h 禁水后，在背景安静的房间内给予大鼠 2 瓶水，分别为1% 蔗糖水和纯水，称重。2 h 后再次称重，计算动物的糖水消耗率，糖水偏爱率 = 糖水消耗 / 总液体消耗 ×100%。通常用于动物情志活动的评价。

② 强迫游泳实验：将单只小鼠放入水深为10 cm的烧杯中，烧杯 20 cm×14 cm。水温（24±2）℃，观察 6 min，计算后 4 min 中内小鼠强迫游泳时不动时间。多用于检测实验动物是否处于“绝望行为”状态。动物在最初入水时，会表现出挣扎、逃脱及游动。当感受到为不可逃脱后，变回采取将头部露出水面、肢体保持不动的漂浮状态。保持不动的状态被称为“绝望行为”。常常用于对抑郁症模型进行评价。

③ 悬吊实验：安静、避光下，将大鼠尾部根部 1/3 处固定于悬尾实验架上，头向下，分别观察不动时间、挣扎次数。观察 5 min。常作为抗抑郁药初筛及抑郁症模型行为学检测的辅助评价指标。产后抑郁症动物模型实验：采用对受孕母鼠分组进行地塞米松（第 1 天起）、地塞米松（第 15 天起）、生理盐水组，分别观察产后母鼠对幼崽的关爱行为和自身积极与消极行为。

关爱行为：噙崽潜伏期、集窝时间、舔崽时间、筑巢时间、噙崽频率。

积极行为：母鼠站立、大步走动、攀越、顶撞鼠笼。

消极行为：母鼠将头部埋于身体下部，频繁无方向无目的的翻动垫料，后头、尾、爪不停骚动的总时间。用于评价母鼠对幼崽的关爱行为和自身积极与消极行为。

6、机体疼痛及反射能力

① 咬肌和颞肌机械性痛觉敏感性的测量实验：动物安静、放松下轻靠在测量者手心，测量点位于眼耳连线中点，向下 10 mm 为咬肌的测量点。采用从小到大标号的尼龙毛，给组织施加不同压力。观察动物有无缩头、抬腿、避开、发出声音等阳性反应。记录反应次数和相对应的尼龙毛编标号。另有研究根据临床接受正畸治疗患者的疼痛程度主要影响进食量的实验，采用记录大鼠每天 24 h 的饮食量、饮水量、体重的方法对 OP（正畸性痛）进行疼痛的定量评价。

② 椎间盘源性下腰痛动物模型实验：观察术后，大鼠的 9 种不同行为学，静止不动、微动、运动、静止时抬足、微动时抬足、运动时抬足、清理皮毛、后腿站立、屈身，通常用于对动物腰痛疾病模型的评价。

③ 机械刺激缩足反射阈值实验：采用 16 个强度不同的刺激，从小到大，分别刺激大鼠两侧足底中心位置，每个强度 10 次。将大鼠出现 5 次以上的缩足反应强度定为对机械刺激的反应阈值，能够测量实验动物对机械刺激的反应阈值。

④ 热刺激反射缩足潜伏期实验：采用热刺激仪器，使大鼠的足底落在照射光圈内，直径为 5 mm，记录从开始照射至大鼠出现缩足逃避反射的时间，此即为热刺激反应潜伏期。

⑤ 饮水抑制的耳鸣动物行为学模型实验：采用部分剥夺饮水的动物放入有持续噪音的背景中，并把噪音的停止与给予电击相结合，使动物意识到噪音停止是危险的，从而主动抑制添水。建立“噪音停止—添水动作减少”的条件反射。多用于评价实验动物是否发生了耳鸣。

Racine 标准：对癫痫小鼠的发作进行分级。

0 级：无反应；

Ⅰ级：节律性嘴或者面部抽动；

Ⅱ级：点头或者甩尾；

Ⅲ级：单肢抽动；

Ⅳ级：多肢抽动或者强直；

Ⅴ级：全面强直阵挛发作。

分别记录小鼠发作的潜伏期、发作程度分级、轻度发作（Ⅰ ~ Ⅲ）次数、重度发作（Ⅳ ~ Ⅴ）次数。

Longa 评分法：常用于脑出血及脑梗死动物模型评价。

0 分：无神经损伤症状；

1 分：不能完全伸展手术对侧前爪或后爪；

2 分：行走时，向手术对侧转圈；

3 分：行走时，向手术对侧倾倒；

4 分：不能自发行走，意识丧失。

Bederson 评分：常用于脑出血及脑梗死动物模型评价。

0 分：无神经功能缺损；

1 分：前肢出现任何屈曲成分，不伴其他不正常；

2 分：侧推抵抗力下降，伴前肢屈曲，无转圈行为；

3 分：同 2 级行为，伴自发性旋转。

肢体对称实验评分：将大鼠置于网中，网眼大小为 2.3 cm×2.3 cm，当大鼠在网格中行走时，计数在 2 min 内其前爪漏到网眼中的次数，即错步数。

计算公式：（脑病变对侧前爪的错步数 - 病变同侧前爪的错步数）/ 总步数。其分值如为正数表明脑病变对侧功能缺损，如为负数表明脑病变同侧功能缺损。

暗盒实验：对动物行为进行评分，良好 0~3分；一般：4~6 分；差：7~10 分。并观察粪便的粒数。粪便粒数反应其紧张的程度。

行为学观察包括：抓取时的反应、进入暗盒时的反应、进入暗盒后的反应、开暗盒时的反应、回饲养笼的反应。

小型猪脑缺血模型神经功能缺失评分：每头实验动物在术后 3 h、6 h、12 h、1~7 d 进行改良的神经功能缺失评分。

总分为 25 分，包括食欲（4 分）、站姿（5 分）、头部位置（2 分）、发声（2 分）、步态（3 分）、运动功能（前肢 / 后肢，4×2 分）以及面瘫（1 分）。

愤怒行为实验，愤怒行为检测：①搏斗次数；②威吓次数；③攀压次数；④胜利次数；⑤失败次数。

行为学得分 = ① + ② + ③ + ④ - ⑤。是通过各项目相加所得总分，来评价动物愤怒模型的方法。

结语：

从实验动物的饲养阶段开始，便要通过动物行为来观察实验动物的健康情况，通过给药、手术及其他干预措施制作动物模型，无论是制作西医的疾病模型，还是中医证候模型的复制，动物行为学始终贯穿于动物实验的整体之中。对于动物学家来说，无论是基础还是应用研究，正确的设计和执行都是实验所必要的。