免疫荧光（石蜡-三标）

免疫荧光 
免疫荧光技术又称为荧光抗体技术，将荧光标记技术和免疫学方法结合起来，利用抗原抗体相互作用从而对组织或细胞内的抗原或抗体物质进行定位、示踪、定性以及相对定量等。

实验意义  
1.免疫荧光技术特异性强、敏感性高、反应速度快、结果清晰明确，在临床检验和科学研究工作上有很高的应用价值。
2.操作简便，便于推广。

实验步骤  
一、脱蜡至水
1. 石蜡切片56℃ 预热3h。
2. 二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ 各5min脱蜡
3. 无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ复水2min。
4. 95%、90%、80%、70%的乙醇各2min。
5. 去离子水洗3min。
6. 1×PBS洗3min×2次。

二、抗原修复
7. 切片置0.01M PH6.0 柠檬酸盐缓冲液中再放入高压锅，盖上盖子及高压阀，待有蒸汽冒出开始计时加热15min。（或CB液中微波中高火5min煮沸，然后中火维持沸腾20min），将高压锅置流水下冲洗减压，安全打开高压锅。
7’. 将切片置于0.01mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却至室温。（煮沸6分钟×4次可能更好）。
8. 让载片在原柠檬酸盐缓冲液中自然冷却至室温，降至室温前切勿取出。
9. PBS浸洗2分钟后滴加0.3%tritonX-100透膜剂透膜12分钟（不透膜也没关系，反正细胞早就被切开了）。但注意细胞膜表面的整合蛋白不能加tritonX-100，否则会被洗掉。
10. PBS洗3min×2次。

三、免疫标记
11. 甩干PBS，正常山羊血清在湿盒中37℃封闭30分钟。
12. 甩去山羊血清，勿洗，种属来源不同的Ab1和Ab2按适当比例混合后滴加于切片样品位置，湿盒中4℃过夜（或37℃ 2h）。注意设置对照.（对照可分为阴性对照、阳性对照和空白对照，根据实验需要设置）。
13. 室温复温45min。
14. PBS洗3min×5次。
15. 甩去PBS，滴加相应的适当浓度的二抗（我这里使用FITC标记的二抗与Ab1结合，TRITC标记的二抗与Ab2结合）。37℃湿盒中孵育1h。
16. PBS洗5min×3次。
17. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果佳。
18. PBS洗2min×4次
18. 封片剂封片，荧光显微镜观察或显微照相。

注意：
1. 在实验过程中勿使切片样品变干，以免影响实验效果。
2. 若一张切片同时做两种抗体的免疫荧光，则加一抗时可将两种一抗按各自所需的浓度混合，但要注意抗体要来源于不同的动物。加二抗时也可将两种二抗按各自所需的浓度混合，但要注意二抗要有不同的颜色。
3. 第7步和第7'步任选一。


大鼠造血干细胞免疫荧光三标图片（图中核标为蓝色，细胞质标记为红色，细胞膜标记为绿色，红绿共标记区为黄色，红、绿、蓝共标记区为白色）。

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