石蜡/冰冻切片TUNEL凋亡荧光

TUNEL凋亡荧光实验原理

dUTP 缺口末端标记（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL ）法检测细胞凋亡的原理是当细胞发生凋亡时，DNA内切酶被激活，核小体间的基因组DNA被切断，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）加上带有荧光素FITC标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜进行检测。

TUNEL凋亡荧光实验意义

1.TUNEL法是一种分子生物学与形态学相结合的研究方法，可对完整的单个凋亡细胞或者凋亡小体进行原位染色，可以准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

2.可用于石蜡切片、冰冻切片、培养的细胞等进行细胞凋亡检测，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学方法要高。

3.操作简便快捷，在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

TUNEL凋亡荧光实验步骤：

1.石蜡切片TUNEL显色法：

①石蜡切片常规脱蜡至水，脱蜡剂二甲苯，至水剂乙醇；

②PBS漂洗3×5 min；

③加入蛋白酶K工作液37℃反应15-30 min, PBS漂洗3×5 min；

④4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室温固定15-30 min，PBS漂洗3×5 min；

⑤浸入封闭液（3%H2O2）室温封闭10 min，PBS漂洗3×5 min；

⑥参考使用试剂盒的说明书配制适量的TUNEL检测液，其中含有TdT酶、荧光标记液、TUNEL检测液；

⑦样品上加入适量TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，PBS漂洗3×5 min；

⑧选择是否用DAPI复染细胞核；

⑨使用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下进行观察。

2.冰冻切片TUNEL显色法：

①新鲜组织经处理后，立即在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为5~6 μm；

②防脱玻片，贴片，室温阴干约12 h；③4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室温固定10 min，PBS漂洗3×5 min；

④浸入封闭液（3%H2O2）室温封闭10 min，PBS漂洗3×5 min；

⑤浸入通透液（0.1%Triton X-100溶于PBS中），室温通透30 S-2 min；

⑥参考使用试剂盒的说明书配制适量的TUNEL检测液，其中含有TdT酶、荧光标记液、TUNEL检测液；

⑦样品上加入适量TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，PBS漂洗3×5 min；

⑧选择是否用DAPI复染细胞核；

⑨使用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下进行观察。

结果展示

实验完成周期及交付标准

1. 实验周期：1-2周

2. 交付标准：蜡块、切片、染色图片、实验报告（实验步骤、试剂、耗材等）

需确认的信息

1. 样本的种属

2. 样本的类型（固定的组织or蜡块or切片）

3. 是否提供试剂盒

4. 拍照要求

参考文献

[1] Kim Y H , Jung J C , Jung S Y , et al. Comparison of the Efficacy of Fluorometholone With and Without Benzalkonium Chloride in Ocular Surface Disease[J]. Cornea, 2016, 35(2):234-242.

[2] Qiu W , Wei R , Zhang C , et al. A glycine site-specific NMDA receptor antagonist protects retina ganglion cells from ischemic injury by modulating apoptotic cascades.[J]. Journal of Cellular Physiology, 2010, 223(3):819-826.

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