医学文献讲解：“用项目管理思维看文献”之《Selene治疗恶性腹水的研究思路剖析》

香菇多糖功能化硒纳米颗粒通过TLR4/TRAF3/MFN I途径靶向肿瘤细胞线粒体

期刊：Theranostics

影响因子：8.579    

发表时间：2020     

恶性腹水是大肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤进展过程中的临床并发症，严重影响患者生存质量和预后、平均生存时间短，其治疗一直是临床难题。恶性腹水目前尚无有效的治疗方法。

香菇多糖(LNT)是从香菇中提取的一种特殊类型的β -葡聚糖，具有广泛的生物和生理活性。在我国临床上应用LNT治疗恶性腹水，安全性高，但效率低。

硒(Se)由于其优异的生物活性和低毒性，在癌症治疗中具有潜在的应用前景。此外，硒纳米颗粒(SeNPs)的生物相容性和有效性优于无机和有机硒化合物。然而，SeNPs在恶性腹水中的作用尚未见报道。

虽然SeNPs可以影响线粒体功能，但纳米粒子主要在溶酶体中降解，可能导致细胞焦亡和坏死，由焦亡和坏死引起的炎性细胞因子可能会降低腹水治疗的疗效。

至此，开发一种能够选择性进入线粒体并从溶酶体中逃逸的新型功能化SeNPs是治疗恶性腹水的重要策略。本文研究评估香菇多糖(LNT)功能化硒纳米颗粒(Selene)对恶性腹水的影响。进一步探讨了Selene对肿瘤细胞线粒体的靶向作用机制。

研究框架分析

一、香菇多糖(LNT)功能化硒纳米颗粒(Selene) 制备与表征

A.香菇功能化硒纳米颗粒(Selene)的合成过程。

B-C. Selene的TEM、AFM图像：分散球形颗粒。

D. Selene的粒度分析：粒径为53.8nm。

E. Selene的EDX检测：NPs主要组成是Se。

F. Selene在生理盐水(0.9% NaCl)中室温稳定性检测:28天。

G. Selene的FTIR光谱：NPs制备交联成功 。

小结：获得了大小及分散均匀、稳定性良好的球形纳米颗粒- Selene。

二、体内腹水模型构建

EAC、OVCAR-3诱导腹水模型，评价Selene对恶性腹水的作用。

01

A.模型建立及给药示意图：当小鼠开始出现腹水时，从建模后的第4天开始用Selene、香菇多糖或SeNPs治疗小鼠。

B.各组小鼠的分组与代表性图像。

C-E .各组体重、腹水体积、腹水中癌细胞数。

小结：Selene、SeNPs对腹水进行有效抑制。

F.模型建立及给药示意图。造模后第7天开始给予Selene治疗，出现大量腹水。

G.不同组小鼠的分组与代表性图像。

H-J.各组体重、腹水体积及腹水中癌细胞数量的变化。

小结： Selene、SeNPs对腹水并无有效抑制。

02

K：模型建立及给药示意图；造模后第7天移除小鼠腹水后给予Selene治疗。

L：各组小鼠的分组与代表性图像。

M-O：各组体重、腹水体积、腹水中癌细胞数量的变化。

小结:

-Selene对EAC诱导的腹水有抑制作用。

-给药最佳时间因应为腹水首次出现时(当出现大量腹水时，应在给药前移除腹水)。

03

A、B:B超检测OVCAR-3诱导腹水体积变化：Selene处理组对腹水进行有效抑制（最显著）。

C: 不同组小鼠的分组与代表性图像。

D、E: 腹水体积及腹水中癌细胞数量：Selene处理组对腹水进行有效抑制。

F:腹水中癌细胞流式细胞凋亡检测结果：Selene处理组细胞凋亡水平最高。

小结： Selene处理组对腹水具有明显抑制作用

04

G.肠和腹壁埃文斯蓝染料渗漏的照片(腹腔血管的渗漏)：尾静脉注射。

H.离心法前后抽吸腹水照片。

I.各组腹水埃文斯蓝含量比较。

J.每个样本20 mL腹水中Fitc葡聚糖强度的照片尾静脉注射。

K. Selene处理组与模型组细胞因子抗体芯片分析结果。

小结：

-Selene对卵巢癌细胞引起的体内腹水有抑制作用。

-Selene降低了炎症因子的表达。

三、分析Selene在肿瘤细胞中的分布及评价Selene对线粒体功能和细胞凋亡的影响

01

A、B：Selene处理组的蛋白组分析结果与对照组比较。

利用GO和KEGG数据库对差异表达

蛋白进行分析，探讨Selene对腹水抑制的主要功能和影响信号通路。

C、D：Selene处理细胞的线粒体膜电位及ROS检测结果：Selene 、SeNPs 明显变化。

E：Selene和SeNPs在OVCAR-3细胞中的摄取效率：Selene 高于 SeNPs 。

F：OVCAR-3细胞线粒体和溶酶体中相对硒含量。

G：透射电镜检测细胞超薄切片：粒子摄入情况。

小结：

-Selene对内吞、凋亡、线粒体等主要功能和信号通路均有影响

-OVCAR-3细胞摄取Selene多于SeNPs

-线粒体中：Selene多 -溶酶体中： SeNPs多

02

H: Selene/SeNPs与溶酶体的共定位结果。

I: Selene/SeNPs与线粒体的共定位结果。

 Selene多位于线粒体、SeNPs多位于溶酶体

J: OVCAR-3细胞的SEM图像：凋亡/焦亡。K: Western blot检测caspase 1和3的表达。

L: Selene和SeNPs处理细胞ATP水平的结果。

M和N: 对Selene和SeNPs处理的细胞Caspase 1和Caspase 3活性的影响。

O: 各组IL-1β含量：SeNPs组高。

小结：

-Selene主要诱导凋亡

-SeNPs主要诱导焦亡

Selene可影响OVCAR-3细胞线粒体功能，诱导细胞凋亡

四、Selene靶向肿瘤细胞的途径

01

A: 不同时间点细胞中Selene积累的免疫荧光结果;

B、C: 采用ICP - MS检测全细胞

和线粒体中Se含量;

小结：随时间的延长、 Selene积聚越多。

02

D：透射电镜检测Selene处理的细胞超薄切片结果

-可能通过内吞途径实现靶向

E：低温(4℃)和能量消耗剂(NaN3 +脱氧葡萄糖)处理后细胞硒含量

-Selene通过（能量依赖的)内吞作用进入细胞

F：用网格蛋白介导的内吞抑制剂(蔗糖和氯丙嗪)、小泡介导的内吞抑制剂(MβCD和制霉菌素)和巨胞饮抑制剂(EIPA和阿米洛利)处理的细胞中硒含量

-小泡介导的内吞为主

G：CO-IP检测TLR4和CAV1的共定位

H和I：TLR4和CAV1免疫荧光双标记结果/IF

J和K：Duolink PLA 检测TLR4和CAV1的共定位

L和M：免疫荧光检测Selene siTLR4处理后线粒体的共定位结果明显下降

小结：Selene通过小泡介导的内吞途径靶向线粒体

五、Selene靶向线粒体的作用途径（体内+体外）

01

A: FpClass数据库分析TLR4和MFN1之间存在潜在桥联蛋白

B: 通过银染色检测以鉴定与TLR4相互作用的蛋白-TRAF3

C-E: Selene处理后TLR4/TRAF3和TRAF3/MFN1的Duolink PLA的共定位表达

 F: CO-IP检测TLR4/TRAF3/MFN1之间具有相互作用

小结：Selene在线粒体中特异性富集，

通过TLR4/TRAF3/MFN1蛋白复合物介导的膜融合。

02

A: 通过OVCAR-3细胞免疫染色分析MFN1/TRAF3和TLR4/TRAF3的共定位。-Selene促进共定位。

B: TRAF3和MFN1敲低后，Selene和线粒体在OVCAR-3细胞中的定位。

-Selene和线粒体在OVCAR-3细胞中的定位水平下降。

C-D: ICP-MS检测TRAF3和MFN1敲除的OVCAR-3细胞中全细胞和线粒体中的硒含量。

-TRAF3和MFN1主要影响了Selene进入线粒体的过程。

小结：

体内实验进一步证明，TLR4与TRAF3敲除后，腹水体积、细胞凋亡水平相较于对照组无明显变化。

Selene通过TLR4/TRAF3/MFN1途径在线粒体中特异性富集。

六、总结

文献总结

●Selene可通过TLR4/TRAF3/MFN1途径靶向肿瘤细胞线粒体，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制腹水炎症因子分泌。

●Selene对恶性腹水有较好的治疗效果，可作为临床治疗恶性腹水的药物。

●TLR4/TRAF3/MFN1是纳米粒子的线粒体靶向分子途径，为开发线粒体靶向抗癌纳米药物提供了理论基础。