【五分钟讲实验】常用的骨髓间充质干细胞（ BMSCs）分离、纯化方法你掌握了吗？

骨髓间充质干细胞（ BMSCs）是在哺乳动物骨髓基质中广泛存在的一类多能基质干细胞，BMSCs因为具有强大的治疗潜能已成为广大研究人员关注的焦点。

BMSCs属于全能型间质干细胞，基于其各种特性，BMSCs广泛用于抗肿瘤基因治疗、造血干细胞移植、组织损伤修复和自身免疫疾病。

现今，在分离、纯化大鼠BMSCs方面，可通过诸多途径来分离BMSCs，应用广泛的包括贴壁筛选、密度梯度离心与骨组织消化法。近年来，还出现了新的方法，如免疫磁珠分选法、流式细胞仪分离法与特殊培养板筛选法。

各类分离、纯化BMSCs方法对比

1. SD大鼠BMSCs分离

通过全骨髓细胞悬液贴壁法完成BMSCs的分离培养，使用颈椎脱臼法将SD大鼠处死，接着马上通过75%乙醇（ET）浸泡大鼠。

取出大鼠后使用碘酒和酒精棉球擦拭四肢进行消毒处理。使用灭菌消毒后的镊子和剪刀将大鼠股骨和胫骨分开，去除肌腱及肌肉，利用PBS反复冲洗干净；随后将股骨和胫骨浸泡在DMEMF-12培养基中，剪掉胫骨、股骨的干骺端，用5号空针针头插入骨髓腔，用DMEM培养液从干骺端和另一端骨髓反复冲洗多次，借助移液器对培养皿中骨髓冲洗液行反复吹打，消除细胞团，得到单细胞悬液；在室温下对骨髓细胞悬液离心，1000rpm，离心5分钟，弃上清，再将沉淀稀释于含15%胎牛血清（FBS）的DMEMF-12培养液中。

预先制备DMEM/F12培养液（内含15%FBS），对分离得到的骨髓细胞悬液进行计数，确保细胞浓度在1×10^6个/mL，将分离所得BMSCs实施原代培养，把培养瓶移至37℃、5%CO₂恒温培养箱内。

第2d借助显微镜查看BMSC的状态，清理掉培养瓶内旧细胞培养液，通过PBS溶液实施2遍或3遍洗涤，再添加新鲜培养液接着培养，如此能够清理掉培养瓶内未贴壁细胞。以后每2-3天对细胞状态进行观察，根据实际情况更换一次培养基，BMSCs一般10天左右细胞生长融合。

BMSCs 的生长情况及形态

待呈80%时细胞生长密度，进入传代培养，期间通过胰酶（0.25%）消化，实施1：2细胞传代，3-5d开始1次传代。

接种BMSCs：准备对数生长期细胞，使细胞浓度呈2×10^4个/mL，进行接种培养，在37℃，5%CO₂培养环境下培养至细胞密度到60-70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基；细胞分化诱导：每2-3天更换成骨诱导培养基，继续在37℃，5%CO₂培养环境下培养14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况，决定终止细胞诱导的时间，进行染色鉴定。

细胞固定：将培养基吸除掉，通过适量1×PBS实施1遍清洗，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min，回收固定液，用PBS清洗残留固定液；

ARS染色：培养器皿底面覆以ARS染液，经过3-5min，回收染液，用PBS清洗残留染液，并加入适量1×PBS避免细胞干燥；

诱导评估：镜检观察、图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。

4. BMSCs成脂诱导与鉴定

接种BMSCs：取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为2×10^4个/mL，进行接种，37℃，5%CO₂培养环境下培养细胞密度至90-100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。细胞分化诱导：于37℃、5%CO₂环境中进行3d培养，再替换成成脂诱导分化培养基诱导液，经过1d培养，接着改用成脂诱导分化培养基维持液，再进行3d培养。按照以上换液频率诱导14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

细胞固定：将培养基吸除掉，通过适量1×PBS实施1遍清洗，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。

油红O染色：取生理盐水或1×PBS与油红O原液配制油红O工作液（油红O原液：生理盐水=3：2），现用现配。向清洗干净的诱导孔内加入适量工作液，静置染色30min；吸走油红O工作液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥；

诱导评估：显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估；诱导成功时，脂滴会与油红O染料结合后呈现红色或橘红色。

① 准备细胞：对培养后的细胞行离心处理（1000rpm，5min）弃去上清，以Buffer溶液重悬，注意观察细胞的分散程度，是否有团块，若有团块，需静置3-5min，弃去团块，并再次静置3-5min，继续观察细胞分散程度，若仍有团块，那么应重复以上操作，添加一定量PBS实施1遍洗涤，将上清倒掉；

② 混匀细胞，对待测定细胞量展开求解，同时借助细胞计数仪统计细胞悬液内细胞量，稀释到所需的细胞数，细胞重悬到5×10^6--10×10^6/mL之间；

③ 取100μL的细胞于EP管或流式管内，按量加入抗体，加入抗体时必须和细胞保持充分的混合，可在震荡仪上稍微混匀。在4℃冰箱孵育30min；

④ 吸取1.5-2mLBuffer溶液，加入流式管内，重悬细胞，1000rpm离心4min后弃去上清；

⑤ 再次重悬细胞，离心后留细胞团。吸取100μLBuffer溶液，加入流式管内，重悬细胞；

⑥ 避光吸取二抗，加入流式管内，加入抗体时必须和细胞保持充分的混合，可在震荡仪上混匀（避光）。4℃进行孵育，计时30min；

⑦ 吸取1.5-2mLBuffer溶液，加入流式管内，小心吹打，使彻底混合，于1000rpm下实施离心处理，经过4min，把上清除掉。

⑧ 吸取400μLBuffer溶液，加入流式管内，轻轻吹打混匀，用滤网过滤细胞，上机检测。

鉴别的标准为借助FCM对CD90、CD105与CD73、的阳性率展开测定，或为CD45、CD34、CD11b或CD14、CD19或CD79α、HLA-DR显示阴性。

应用最广泛的染色手段是ARS染色法，ARS染色与主要调控基因BMP2，Runx2表达证实BMSCs有潜在成骨分化能力。

应用最广泛的染色手段是ORO染色法，经由ORO染色与PPARγ标志基因的表达，对BMSCs具备成脂分化活性加以明确。

1. 大鼠BMSCs的分离和培养

大鼠BMSCs的分离：用颈椎脱臼法将SD大鼠处死，然后立即将其浸泡在75％酒精里。碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，PBS溶液冲洗两遍。从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注射器吸取DMEM／F12溶液冲出骨髓细胞多次，再用针头吹打，将骨髓细胞用吸管吸入到离心管内，离心5min，把上清液移除，用PBS溶液重新使骨髓细胞悬浮。慢慢的向离心管中加入细胞悬液，离心管容量为15ml，此离心管内预先装5ml细胞分离液，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，淋巴细胞分离液可将骨髓细胞分层，一定要注意液面不可以被搅动，分离液与细胞悬液的分层保证不被破坏。

将装有细胞混悬液和淋巴细胞分离液的离心管离心20min，完成离心操作后的溶液会有四层的分层，吸取中间骨髓基质细胞层，即颜色为为白色的浑浊状层，最后用PBS溶液清洗三次。

大鼠BMSCs的培养：向培养瓶中添加胎牛血清与DMEM／F12溶液，细胞浓度为10^6／ml，将培养瓶放置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行细胞培养24ｈ后将培养瓶中的细胞培养液弃去，用PBS溶液冲洗２～３次，然后加入培养液继续培养，目的是去除培养瓶中未贴壁的细胞。以后每３ｄ半量换液１次，一般10ｄ左右细胞生长融合。用0.25％的胰酶消化培养瓶中的贴壁细胞，然后1:2进行细胞传代，一般３～５天进行１次传代，选取第三代细胞进行之后的实验过程。

用６孔板培养细胞，待细胞生长达到60％～70％，弃掉旧培养基，用0.25％胰酶消化细胞，收集到离心管内。1000rpm离心5min，沉淀细胞。然后对细胞进行沉淀。但是对于一些特定的细胞，如果这些细胞沉淀的不充分，离心时可以适当的延长离心时间或使离心力变大。小心的吸去离心管中的上清液，可以残留约50μｌ的培养基。加入预冷的PBS溶液约1ml来重悬细胞，再次离心用来沉淀细胞。然后再次重复上述步骤，重悬细胞后调整细胞密度至２×10^7/ml。

轻轻的弹击离心管底部以适当的分散细胞，避免细胞凝集成团。在每个流式检测管中加入50μl稀释后的R－CD29－PE/R－CD44－PE和R-CD3leFluor660/R-CD45eFluor660抗体。同时设置空白管，在空白管加入50μlStainingBuffer。在每个流式检测管中分别加入50μｌ的细胞悬液，细胞数量约为10^6，并且将细胞轻轻地混匀，不要太用力。将流式检测管进行冰浴或在４℃冰箱中避光孵育20min。冰浴或者孵育完成后，加入StainingBuffer（每个流式检测管中分别加1ml）。转速为1000rpm、４℃离心5min，然后弃去离心管中的上清液，用PBS溶液重复洗涤过程３次。最后100μｌ重悬细胞后上流式细胞仪进行检测，共检测四种细胞表面抗原 CD29、CD31、CD44、CD45的表达。

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