【五分钟讲实验】细胞冻存与复苏常见问题及解决方法

细胞冻存和复苏是在细胞研究和生物医学领域中常见的实验技术，用于长期保存和重复使用细胞。

1. 细胞存活率低：有时，在冷冻和复苏过程中，细胞的存活率可能会较低

① 确保使用新鲜和健康的细胞进行冻存。

② 控制好细胞密度，在适当范围内进行冷冻。

③ 使用合适的冻存液和冷却速率。

④ 在复苏过程中尽快进行快速复苏，并采用温和的解冻方法。

2. 细胞冻存为什么要添加保护剂?

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶从而引发一系列的不良反应：

首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。

其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。

最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。

添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。

3. 冷冻管应如何解冻?

从液氯中取出细胞置-80℃冰箱中数分钟，让管中液氛挥发后，再放入37℃的水

浴锅中(预防冻存管爆裂)，轻摇冻存管使其最好在2min内全部融化，并注意水面不可超过冻存管管口，否则容易造成污染。

4. 冷冻管或容器标记丢失或模糊，导致样本识别困难。

在冷冻之前，确保正确标记冻存管或容器上的样本信息，并记录详细的细胞类型、冻存液组分和处理步骤等信息。

使用耐久性好的标记方法，如抗水消融墨水或永久性标签。

5. 高效进行细胞冻存应该注意什么?

① 缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

② 细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、致密度约为80-90%活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

③ 冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。

④ 冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

⑤ 冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。我们建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。

6. 细胞冻存和复苏的最佳时间是什么时候?

细胞在体外生长期间，通常分为三个阶段:潜伏期、指数生长期和平台期。潜伏期通常是细胞刚刚传代，此时细胞开始贴附基质和伸展骨架，代谢活动集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表达，细胞量在这段时间内几乎没有增加。

随后，细胞开始指数生长期，核酸转录翻译旺盛，DNA解旋、配对频繁，胞内物质传递迅速，细胞数量迅速增长。如果在这个时期冻存，实际上是强行将细胞冻结在代谢的某一时刻，势必造成对解旋的DNA、转录翻译中的RNA和蛋白的机械损伤，增加个别环节发生错误的风险。

随着细胞数量的增长，培养容器内，细胞汇合达到90%以上。大部分细胞因为“接触抑制”而停止高速代谢和增殖，胞内活动趋于平缓。

所以，我们建议在刚刚进入平台期时冻存细胞，既可以获得足量的细胞，也不会对细胞造成过多的机械损伤。

7. 细胞解冻后不适应培养环境或缺乏活力。

解冻后立即将细胞转移到预先准备好的培养基中。

逐渐稀释细胞并适应新的培养环境。

定期检测细胞的活力和功能状态，并根据需要进行培养条件的优化。

8. 临床手术切下来的肿瘤组织的冻存和复苏应该怎么做?

不论是肿瘤组织、正常组织或细胞的冻存和复苏需要把握的关键都是“慢冻快融”。

组织冻存中使用的“玻璃化液”和细胞冻存中使用的“冻存液”作用的本质都是结合或吸收细胞内的自由水，避免或减少细胞在冷冻过程中，胞内的自由水凝结为冰晶刺破细胞。

通常，环境温度在-5~-10℃之间时，细胞内开始形成冰晶。快速的冷冻会加剧冰晶的形成，所以，我们在冻存细胞时会使用程序降温仪，含异内醇的程序降温盒或者特质的泡沫盒。这些仪器、设备、试剂的使用都是为了减缓细胞冷冻速度。

至于复苏，我们一般是在37℃水浴锅中震荡，让细胞、组织迅速度过“冰晶危险期”。

9. 细胞在液氮中可以保存多久?

细胞冻存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年复苏1次后，再继续冻存。

1. 细胞冻存注意事项

① 选择适合的冻存液：根据细胞类型选择合适的冻存液，常用的包括含有冷冻保护剂（如DMSO、甘油）的培养基或冻存液。DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞。

② 细胞密度控制：要控制好细胞的密度，避免过度或不足密度冷冻。通常，细胞密度应该在适当的范围内，以确保细胞在冷冻和复苏过程中的存活率。细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液；

③ 不建议手动梯度降温，温度不稳定，容易降低存活率；

④ 注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果；程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用；

⑤ 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱，不需要放4度；

⑥ 使用适当的冷冻容器和方法来实现较快的冷却速率，以避免冰晶形成对细胞造成的损伤。常见的方法包括使用液氮浸泡法或冷冻慢冷器。-80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存，转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温暴露，避免冻存管融化；

⑦  若没有液氮罐，存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。

⑧ 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存；

⑨ 由于没有使用冻存盒，在转入液氮的过程中一定要对冻存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保护后转移，操作过程注意安全；

⑩  转移过程要快，避免冻存管暴露于常温后融化；若没有液氮罐，存放在-80度冰箱的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。

2. 细胞复苏注意事项

① 水浴锅的位置如果与液氮罐不是一个房间，需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁，避免路途细胞表面融化；尽量迅速将冻存管或容器从液氮中取出，并立即将其置于37°C的水浴中进行快速复苏。

② 温和解冻：使用适当的方法解冻细胞，如将冻存管放入37°C的水浴中直至完全解冻。避免使用高温或暴露时间过长的方法，以免对细胞造成热伤害。

③ 细胞溶解过程快速摇晃以加速溶解。

④ 已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放，尽快离心去除DMSO。

⑤ 贴壁细胞复苏24小时后观察，若密度达到80%，则正常传代；若密度不到80%则继续培养到48小时再换液。

⑥ 稀释和培养：在解冻后，立即将细胞转移到预先准备好的培养基中，逐渐稀释并适应新的培养环境。控制好培养基的温度和含有适当的营养物质。

⑦ 悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液。

⑧ 对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心，减少操作步骤，也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内，补加新鲜培养基，放入温箱内培养。

以上解决方案提供了一些常见问题的应对方法。然而，不同的细胞类型和特殊的实验条件可能会有不同的具体情况和解决方案。

因此，在进行细胞冻存和复苏操作之前，最好参考相关文献、咨询领域专家，以获得更具体和准确的指导。