Bacteriophage targeting microbiota alleviates non-alcoholic fatty liver disease induced by high alcohol-producingKlebsiella pneumoniae

以微生物群为靶向的噬菌体可缓解高产酒精肺炎克雷伯菌引起的非酒精性脂肪性肝病

期刊：Nat Commun.

IF：17.694

接收日期：2023.6.3

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，指除外酒精和其他明确的损肝因素(如病毒、药物、细菌等)所致的，病变主体在肝小叶，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性和脂肪贮积为病理特征的临床病理综合征。

NAFLD 是全球最常见的慢性肝病，全球约有25%的人口患有NAFLD，预计NASH的发病率在未来10年内增加56%。而在中国，NAFLD在慢性肝病的占比约为49%。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种革兰氏阴性，不运动的，包囊的杆状芽孢杆菌，存在于人类和非人类灵长类动物的鼻咽和胃肠道中。属于克雷伯氏菌属和肠杆菌科。是兼性厌氧的，氧化酶为阴性，并从乳糖产生酸和气体。肺炎克雷伯菌可以自然存在于健康个体的肠道和呼吸道中，具有健康免疫系统的人很少发生感染疾病。

高产乙醇的肺炎克雷伯氏菌（HiAlc-Kpn) ；可以在肠道中将碳水化合物发酵成酒精。通过门静脉系统输送到肝脏，导致肝细胞脂肪变性和脂质代谢紊乱，从而导致NAFLD。

1. 噬菌体phiW14的基因组和生物学特征。

1.phiW14的潜伏期为10min，爆发期为80min，平均斑块形成数约为129个PFU/ml;

2.在MOI 10至0.0001时，phiW14完全抑制HiAlc-Kpn-HK1，最佳MOI为0.001；

3.phiW14在pH 5至10时和在温度4°C至40°C时，状态最稳定；

病毒感染复数（MOI）：感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。

1.phiW14：50247bp的环状双链DNA，具有79个假定的开放阅读框，但没有耐药性或毒力基因； 

2.phiW14主要包括生物合成、转录、迁移、运输和代谢等相关的26种蛋白； 

3.phiW14适宜的生物学特性，广泛的宿主谱，特异性的基因结构都表明：phiW14可能是治疗NAFLD的潜在候选者。

综上所述，这些结果表明phiW1可能是治疗内膜AFLD的潜在候选者。

2. 体外噬菌体预处理后的HiAlc Kpn喂养小鼠和粪便微生物群移植（FMT）

Pair-fed：灌胃生理盐水（阴性对照） ；

EtOH-fed：灌胃酒精（阳性对照）；

HK1-fed：灌胃高产酒精肺炎克雷伯氏菌（模型组1） ；

HK1/phiw14-fed：灌胃高产酒精肺炎克雷伯氏菌+phiW14（HK1致死）（模型1治疗组1）；

HK1/phikp15-fed：灌胃高产酒精肺炎克雷伯氏菌+phikp15（ HK1不致死）（模型1治疗组2）；

FMT组：灌胃NASH患者粪便（模型组2）；

FMT/phage组：灌胃NASH患者粪便+噬菌体治疗（模型2治疗组）。

噬菌体治疗可以通过特别消除受体小鼠粪便微生物群中的HiAlc-Kpn来预防脂肪性肝炎。

3. 噬菌体疗法重新编程肠道微生物群，无明显副作用

将患有脂肪性肝炎的小鼠用噬菌体W14在104（低浓度，LC）、105（中浓度，MC）和106（高浓度，HC）PFU分别处理1、4和7天。

噬菌体phiW14可以通过清除HiAlc-Kpn来逆转脂肪肝，并且没有任何副作用。

4：噬菌体靶向HiAlc Kpn缓解体内脂肪性肝炎

噬菌体或抗生素治疗可能是通过调节Scd-1等脂肪生成基因下调，Pparα等脂肪分解基因上调改善脂肪肝病变；

尽管在用噬菌体和抗生素处理的小鼠都可以通过清除HiAlc-Kpn进而减轻脂肪性肝炎,但使用抗生素的长期治疗会导致肠道菌群的变化，甚至导致菌群失调；相比之下，噬菌体治疗更为安全。

5. 体内噬菌体疗法诱导的转录和代谢重编程

转录组学：噬菌体治疗后，脂肪性肝炎小鼠的肌肉合成相关途径上调，而炎症或细胞凋亡的途径，如Wnt信号通路下调。

相反，抗生素治疗上调了生物过程相关途径，但下调了炎症和细胞凋亡途径和MAPK途径。

在噬菌体治疗后的小鼠中，富含甘油脂质代谢途径的代谢产物柠檬酸以及甘油-磷脂代谢途径的甘油3-磷酸的量增加，而糖酵解和糖异生途径中的L-乳酸减少；

在抗生素治疗后的小鼠中，富含戊糖和葡糖醛酸相互转化途径

这些数据表明，噬菌体疗法对HiAlc Kpn诱导的脂肪性肝炎小鼠具有疗效，不仅通过靶向HiAlc Kpn，还通过调节炎症，脂质代谢和碳水化合物代谢。

6. 噬菌体疗法有效缓解HiAlc Kpn诱导的无菌小鼠脂肪性肝炎

与噬菌体在SPF小鼠中的作用类似，NASH患者的肠道菌群在无菌小鼠中引起脂肪性肝炎。通过噬菌体治疗后，脂肪性肝炎的相关指标，如病理变化和血清学指标均得到缓解，另外肺炎克雷伯菌菌株在无菌小鼠的肠道中被消除。

7. 噬菌体治疗在NASH小鼠模型中的疗效

MCD组：蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠模型组，作为空白模型组；

MCD+HK1组：MCD喂养+HK1灌胃，作为模型处理1组； 

MCD+HK1+phiW14组：MCD喂养+HK1和phiW14灌胃，作为模型处理2组；

MCD+phiW14组：MCD饲养+phiW14灌胃，作为模型处理3组；

MCS组：补充蛋氨酸胆碱喂养，作为阴性对照组。

从16S rRNA测序的结果来看、噬菌体治疗仅能够特异性的杀死HiAlc-Kpn；而对其它实验组的小鼠菌群结果没有影响。

NAFLD的致病机制存在多样性；

噬菌体治疗可能具有高度特异性。

与MCD组相比，MCD+高产酒精肺炎克雷伯菌组在肝脏脂肪变性和炎症方面有更严重的病理变化，但噬菌体治疗后，肝脏病变明显减轻；而MCD+噬菌体组几乎和MCD组一致，噬菌体治疗并没有减轻脂肪性肝炎。

①高产酒精的肺炎克雷伯菌是导致非酒精性脂肪性肝病原因之一，其抗生素耐药性会显著影响临床效果；

②筛选出一种不含溶源性、耐药性或毒力因子的裂解噬菌体phiW14，可以作为抗生素治疗的替代品，具有潜在的疗效和安全性，可作为治疗内源性酒精性脂肪肝病的候选药物；

③噬菌体疗法能够缓解肺炎克雷伯菌引起的脂肪性肝炎，包括肝功能障碍以及细胞因子和成脂基因的表达；

④噬菌体疗法不仅可以靶向抑制肠道菌群中的肺炎克雷伯菌，还可通过调节炎症、脂质和碳水化合物代谢来预防脂肪性肝炎；

不足：

①如何扩大噬菌体的抗菌谱进而应用于更多的细菌感染？

②是如何防止细菌CRISPR系统抵御噬菌体？

③如何选用正确剂量的噬菌体用于治疗？

④如何避免噬菌体的细胞毒性？

展望：

噬菌体疗法可以作为抗生素治疗的替代品，具有潜在的疗效和安全性，而本文筛选出一种不含溶源性、耐药性或毒力因子的裂解噬菌体phiW14，可作为治疗细菌性酒精性脂肪肝病的候选药物，填补NAFLD的临床治疗的空白。