【5分钟讲透实验】影响ELISA结果的因素综述

ELISA酶联免疫吸附试验是目前临床上最常用的免疫学检验方法，由于其试剂稳定，易保存，操作简便，结果判断较客观，既适宜于大规模筛查试验，又可用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析，目前已广泛用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子检测等领域。

样品是检测的前提，样品质量会直接影响实验结果。可以用ELISA来检测的样品很多，根据检测项目不同可以是血清、血浆、唾液、尿液等，但大部分还是以血清为样品。作为血清样品，应避免溶血，溶血可能会增加非特异性显色，导致结果出现误差。

血清样品的反复冻融会使血清中的抗体效价下降，所以需要多次检测的血清样品，如在5d内检测完，可4℃保存，如需长时间检测，可进行分装冻存。样品如被细菌污染腐败，可能会导致假阳性。

温度主要影响抗原抗体反应，酶促反应速度及非特异性吸附，温度升高可使抗原抗体结合反应加速，但也易引起抗原抗体复合物的解离。酶促反应速度同样随温度升高而增快，但是酶蛋白变性也加快，丧失酶学活性，降低酶的有效浓度而减慢反应速度，温度低时以前者为主，高时以后者为主。

温度是质量控制的一个重要方面，一般允许±1℃的误差。最好水浴，微孔板浮在水面，使温度迅速平衡。如放温箱内温育，微孔板不应叠置，为避免蒸发，板上应加盖，盛放微孔板的湿盒应是金属的，传热容易。空湿盒应预先放在温箱中，以平衡温度，在室温较低时更需要。

在温度保证的前提下，时间的控制至关重要，尤其是底物显色的时间控制，显色时间不足或过长会导致实验不成立，无法对检测结果进行判断。

加人标本、试剂及混合的时间称为操作时差。操作时差在每个试验中都存在，对结果或多或少有影响。对手工操作，尤其是样品量大的项目，从加人第一个标本到最后一个标本，需几十分钟，加人试剂及混匀存在很大的时间差异，使抗原抗体和酶促反应时间不一致，易产生假阳性、假阴性结果。

因此，样品过多时，请选择分批操作，对勿须更换移液口吸嘴的酶结合物，底物的加样可选择8联或12联专用的多道加液器。亦可避免单孔滴加底物时遗漏多加。

ELISA成品试剂盒为检测工作提供了方便，按照说明书进行操作就可以完成实验，但人为操作时候很多细节也会导致实验误差。

1. 包被

一些ELISA反应板需要自行进行包被处理，没有进行包被，或包被液使用与检测项目不同都会使实验失败。包被时，未进行震荡，孔底未被包被液全部覆盖会导致检测结果偏差。

2. 反应液稀释

稀释液使用错误或稀释比例不正确会导致实验失败或结果不准确。

3. 洗板

人工洗板时，弃去洗涤液时方法不当，易使各孔液体相互流入，导致假阳性；洗涤液使用量和洗涤次数过少导致洗涤不彻底，洗板后未拍板或拍不干净都会影响实验结果。

仪器设备是ELISA实验的基础，常用的相关仪器设备包括移液器、酶标仪、洗板机和恒温箱等。所有设备都需要进行检验校准，保证准确性和精确度。

移液器的使用要尽可能选择所需加液量接近最大量程，并正确使用，减少实验误差。

酶标仪要提前开机预热，保证光源稳定；洗板机要检查加液孔是否通畅，保证加液量。

恒温箱要提前开机，开、关门要快速，保证反应温度。

试剂盒要根据要求进行保存，并保证在有效期内使用，使用前应平衡到室温。新购入的试剂盒要进行校验，检查实验是否成立，不同的试剂盒或不同批号的试剂不可混用。

显色是ELISA中的最后一步反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。

在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延。

封板膜封闭不严或开启时孔内液体蒸发、震出可导致各孔相互污染；操作时接触到ELISA板底导致透光度改变，影响酶标仪测量结果；

加样图省事，未认真更换移液器吸头，认为其带入标本残留量小，不易影响结果，是部分检测人员常有的心理。因此加标本时必须认真更换移移液器吸头，防止移液器吸头残留痕量产生假阳性结果。加样时应防止溅出污染其它标本。

ELISA的比色测定由酶标仪进行测定，故需强调比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否是双波长（450nm和630nm）。

（非试剂盒本身的原因），总结如下：

1.弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。

2.测定的重复性差，这是由于测定操作引起的问题，包括：

（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；

（2）加样过快，孔间发生污染；

（3）加错样本；

（4）加样本及试剂时，加在孔壁；

（5）不同批号试剂盒中组分混用；

（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；

（7）孔内污染杂物。

3.全部孔都不显色。

（1）漏加酶结合物；

（2）洗板液配制中出现问题；

（3）漏加显色剂A或B；

（4）终止剂当显色剂使用。

4.全部板孔均有显色。

（1）板不干净；

（2）显色液变质；

（3）洗板液受酶等污染.

ELISA实验现在已成为实验室最为常见的实验,几乎人人都能做,但真正做好的没有几个,究其原因就是步骤比较简单,一学就会,却往往抓不往关键,一个小环节的错误,最终会影响整个实验结果。

要保证ELISA实验的检测质量，必须对ELISA实验的全过程进行全面质量控制。严格按照实验步骤进行操作,对每一个环节进行优化,提高实验结果的精确性,从而保证实验结果的真实性和客观性。

关注公众号，了解更多实验技巧！