国自然热点细胞衰老研究之 “BH3类似物特异性清除化疗诱导的衰老细胞并提高对TP53野生型乳腺癌的敏感性”

BH3 mimetics selectively eliminate chemotherapy-induced senescent cells and improve response in TP53 wild-type breast cancer 

BH3类似物特异性清除化疗诱导的衰老细胞并提高对TP53野生型乳腺癌的敏感性

期刊：Cell Death & Differentiation           

发表时间：2020             

影响因子：12.784                     

TP53基因，是非常重要的抑癌基因，在所有的恶性肿瘤中，超过50%会出现该基因的突变。p53能对细胞应激作出反应，如化疗引起的，通过开启参与细胞凋亡、细胞周期阻滞和衰老相关基因的转录。对于接受化疗的患者，TP53突变型肿瘤比野生型更有利，野生型TP53肿瘤患者在化疗后的生存率明显较差。前期小鼠动物建模实验证明，p53野生型乳腺肿瘤在化疗后发生了衰老而不是凋亡。

细胞衰老，是指细胞基本结构发生变化，代谢速率降低从而导致细胞增殖和分化能力衰退的一种状态。实体肿瘤的细胞，特别是衰老的细胞，很难被杀死。已经有充分的研究证明，许多因化疗导致衰老的肿瘤细胞在休眠状态下会产生衰老相关分泌表型（SASP）的细胞因子和趋化因子。这些因子促进了致瘤特性，如增殖、存活、血管生成，增加癌症干细胞群，并抑制免疫系统，因此，消除持续存在并促进复发的衰老细胞对提高患者的生存率至关重要。TP53野生型乳腺肿瘤患者对化疗的反应很差，乳腺癌的70%为TP53野生型，针对这些患者开发更好的治疗方案的临床需求并未被满足。

目前已发现了几种作为癌症治疗开发的促凋亡BH3模拟药物，这些药物可以清除培养中的衰老、正常的二倍体成纤维细 胞，或老年小鼠中的衰老细胞。它们包括BCL2 抑制剂ABT199，已被FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病，以及ABT-263，它抑制BCL2、BCL-XL和BCL-W，并在造血系统癌症中具有活性。虽然这些药物在实体肿瘤中的活性相对较小，但是否可通过这些药物配合化疗消除衰老的肿瘤细胞改善化疗反应和延长生存期，作为一种新的治疗方案有待进一步验证。

是否可通过清除肿瘤中的衰老细胞抑制肿瘤进展、减少肿瘤复发，提高患者生存期？

1.发现化疗可诱导癌细胞衰老的现象；

2.确定了间质中残留的衰老细胞是肿瘤复发的因素；

3.发现了ABT-263可促进阿霉素诱导的衰老细胞发生凋亡的机制； 

4.验证了ABT-263通过靶点BCL-XL、MCL1调控细胞凋亡； 

5.验证了ABT-263 可在体内抑制乳腺癌进展、延长小鼠生存期。

1.1  化疗诱导癌细胞衰老

阿霉素（Doxo）处理癌细胞系后，β-半乳糖苷酶染色检测；结论：化疗可诱导癌细胞衰老。

2.1  ABT-263降低化疗处理的乳腺癌细胞4226增殖活性

促衰老药物ABT-263干预阿霉素（Doxo）化疗处理的癌细胞系，细胞活力显著降低。

结论： ABT-263对正常细胞增殖无影响，特异性诱导衰老癌细胞死亡。

2.2   ABT-263促进TP53野生型癌细胞中衰老细胞死亡

促衰老药物ABT-263干预阿霉素（Doxo）化疗处理的癌细胞系，筛选出5个对ABT-263敏感的TP53野生型癌细胞系；3个对ABT-263有耐药性的TP53野生型癌细胞系，联合MCL1抑制剂（ABT-263耐药预测因子）S63845处理后，细胞活力显著降低。

结论：ABT-263可诱导TP53野生型癌细胞中衰老细胞死亡；

2.3   ABT-263促进TP53突变型癌细胞中衰老细胞死亡

ABT-263干预阿霉素（Doxo）化疗处理的TP53突变型癌细胞，细胞活力下调，相比TP53野生型癌细胞，下调趋势更低。

结论：TP53野生型癌细胞对ABT-263敏感性更高。

2.4  ABT-263抑制癌细胞活性需要细胞进入衰老程序

在阿霉素治疗后的不同时间点用ABT-263处理细胞，以确定敏感性的时间。

结论：4226和U2OS细胞在阿霉素处理3天后进入衰老程序，而SKBR7和A549细胞需要4-5天。

在阿霉素治疗后的不同时间点用ABT-263/ S63845处理ABT-263耐药细胞。

结论：MCF-7和MDAMB-175在阿霉素治疗后3-4天对ABT-263/ S63845治疗也最为敏感，综上所述，大多数癌细胞系，需要3-5天进入衰老程序才能达到最大的衰老敏感性。

3.1  ABT- 263对不同应激因素诱导衰老的治疗方法同样有效

辐照/紫杉醇化疗后， ABT-263/ S63845处理癌细胞，细胞活力下降。

3.2  ABT- 263对非环境应激诱导衰老的治疗方法同样有效

用Nutlin-3a处理细胞，在没有应激的情况下，通过阻断MDM2-p53的相互作用来有效地异位激活p53，诱导出了特有的衰老表型。

结论：细胞对不受DNA损伤或有丝分裂胁迫的情况下的衰老药物同样敏感。

4.1  ABT-263促进阿霉素诱导的衰老细胞凋亡

在泛半胱天冬酶抑制剂QVD-OPh存在或不存在的情况下，用ABT-263处理。细胞凋亡抑制剂挽救了ABT-263/S63845处理后导致的细胞数量的减少。

结论： ABT-263是通过促进衰老细胞凋亡减少癌细胞数量。

用衰老药物ABT-263/S63845处理阿霉素诱导的衰老Cal51和MDA-MB-175细胞，PARP在2-4小时内完全转化为其裂解形式。在未使用ABT-263处理，未观察到PARP的裂解。

结论：衰老癌细胞对凋亡具有抗性。

免疫荧光检测凋亡相关指标。

结论：衰老药物可特异性诱导衰老细胞caspase 3的激活，进入凋亡程序。

ABT-263/S63845干预阿霉素诱导的衰老细胞后，检测线粒体和凋亡介导因子BAX共定位；BAX定位于经衰老处理的衰老细胞的线粒体中。

4.2  衰老细胞优先被抗衰老药物靶向

衰老细胞有一个扩大的溶酶体室，通过溶酶追踪染料染色，实时成像追踪衰老细胞，阿霉素处理的ABT-263/ S63845敏感细胞在使用衰老药物治疗后数小时内发生细胞死亡。

4.3  衰老细胞可吞噬邻近的细胞延长自身生存时间

发现衰老细胞可吞噬邻近的细胞的现象，推测衰老细胞可通过该方法延长自身生存时间。

混合表达GFP和mCherry的细胞，用阿霉素处理以诱导衰老和吞噬表型，然后用适当的抗衰老药物处理。延时显微镜显示两种细胞系都有主动吞噬。

4.4  BCL-XL和MCL1介导阿霉素诱导的衰老细胞的存活

联合ABT-263/ S63845、阿霉素处理VCF-7和MDA-MB-175细胞，使用BCL2抑制剂A1852-133和MCL1抑制剂S63845干预抑制通路激活，检测细胞活力变化；衰老的、化疗治疗的乳腺癌细胞的存活是由BCL-XL介导的，而在A/s敏感细胞中是由BCL-XL或MCL1介导的。

5.1  体内实验验证ABT-263抑制乳腺癌进展延长小鼠生存期

构建乳腺癌原位移植小鼠模型，先用阿霉素治疗，然后进行ABT-263治疗。在所有的实验中，肿瘤对单独的ABT-263治疗没有反应， 化疗后再进行ABT-263治疗的小鼠生存时间更长。

5.2  体内实验验证ABT-263促进化疗诱导的衰老肿瘤发生凋亡

阿霉素放疗后再ABT-263治疗，采集肿瘤免疫荧光检测凋亡相关因子表达，与细胞实验结果一致，ABT-263促进阿霉素放疗后肿瘤细胞凋亡。

BH3类似物ABT-263通过靶向BCL-XL/MCL1通路促进阿霉素诱导的衰老细胞凋亡抑制乳腺癌进展。

创新点：

发现了促衰老药物ABT-263通过靶向BCL-XL/MCL1促进放疗、化疗诱导的衰老细胞发生凋亡的机制。

为消除肿瘤间质中残留的衰老癌细胞，临床上减少癌症复发提供了改进的联合给药策略和理论依据。

不足：

发现了衰老细胞可通过吞噬邻近细胞的现象，推测通过该途径维持衰老细胞生存时间，但未进一步验证。

还是老药新用的研究思路，可进一步通过单细胞测序挖掘更多的维持衰老表型新靶点。