细胞凋亡检测

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡，是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

【应用简介】 

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡，是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

【技术原理】 

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。因此Annexin V作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinⅤ进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙锭（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

【实验方法】 

Step1：细胞培养 

Step2：转染或药物处理 

Step3：细胞收集 

Step4：加凋亡试剂 

Step5：上机检测

【案例展示】 

【技术总结】

1、考虑到进行流式时需要用到对照组细胞设置空白组（用于调节电压）和单染组细胞（用于调节补偿），因此要求该组细胞量较其他组多； 

2、如发现细胞密度偏低，细胞量较少，则适当增加离心时间。收集细胞时，应该连同上清一起收集，同时胰酶消化时间不宜过长，否则容易引起假阳性；

3、检测细胞经过转染等处理后可能会带有自发荧光，应注意选择凋亡试剂盒的颜色通道 如：带绿色荧光时，应选择7AAD试剂盒；

4、细胞铺板应选择细胞状态良好的时候进行，且避免反复吹打；

5、流式样品检测需提前2-3个工作日预约。 流式检测细胞样本：细胞样品准备时，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，不得使用细胞刮刀进行操作，胰酶消化细胞时切忌消化过头或没有完全打开细胞间隙；

6、由于细胞活性问题，只接受活细胞样本，当天完成实验。