细胞凋亡检测

时间:2020-12-03浏览次数:322

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡,是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。


【应用简介】 

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡,是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。


【技术原理】 

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。因此Annexin V作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinⅤ进行荧光素FITC标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。


【实验方法】 

Step1:细胞培养 

Step2:转染或药物处理 

Step3:细胞收集 

Step4:加凋亡试剂 

Step5:上机检测


【案例展示】 

u=2534930003,3028141035&fm=26&gp=0.jpg


【技术总结】

1、考虑到进行流式时需要用到对照组细胞设置空白组(用于调节电压)和单染组细胞(用于调节补偿),因此要求该组细胞量较其他组多; 

2、如发现细胞密度偏低,细胞量较少,则适当增加离心时间。收集细胞时,应该连同上清一起收集,同时胰酶消化时间不宜过长,否则容易引起假阳性;

3、检测细胞经过转染等处理后可能会带有自发荧光,应注意选择凋亡试剂盒的颜色通道 如:带绿色荧光时,应选择7AAD试剂盒;

4、细胞铺板应选择细胞状态良好的时候进行,且避免反复吹打;

5、流式样品检测需提前2-3个工作日预约。 流式检测细胞样本:细胞样品准备时,使用不含EDTA的胰酶消化细胞,不得使用细胞刮刀进行操作,胰酶消化细胞时切忌消化过头或没有完全打开细胞间隙;

6、由于细胞活性问题,只接受活细胞样本,当天完成实验。