基于生物质谱的蛋白鉴定、定量、翻译后修饰分析

时间:2018-11-16浏览次数:1045

实验原理

蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物,在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子,质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(即质荷比,M/Z)的肽段离子分离开来,经过检测器收集分离的离子,确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z,得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱,即蛋白质的一级质谱峰图。离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析,输出选取肽段的二级质谱峰图,通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。根据离子源的不同,目前用于蛋白分析的主流质谱技术主要有电喷雾离子化质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解析电离质谱(MLADI-MS)。质量分析器主要有四极杆分析器(QE)、离子阱分析器(Orbitrap)、飞行时间分析器(MLADI -TOF)。


生物质谱在蛋白分析方面的应用

1. 蛋白鉴定:由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)不同,蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异,肽混合物质量数亦具有特征性,称为肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint,PMF),可用于蛋白质的鉴定。

2. 蛋白定量:基于稳定同位素标记法,如SIL AC、QconCAT、iTRAQ等;基于质谱归一化的非标定量法,如蛋白丰度指数法PAI、多肽匹配数、谱图计数、碎片离子峰强度(iBAQ),SWATH等。

3. 蛋白翻译后修饰:根据特定修饰基团的图谱特点进行翻译后修饰的鉴定和定位,包括磷酸化、糖基化、巯基和二硫键定位、乙酰化、泛素化等。


实验步骤   

①组织或细胞蛋白提取;

②蛋白酶消化,将蛋白样品制备成多肽;

③多肽抽提和质谱仪分析,产生肽段质荷比和肽离子质量;

④搜库、打分、输出排序;

⑤搜库后分析,蛋白鉴定、定量或翻译后修饰分析。


实验完成周期及交付标准 

1. 实验完成周期10~30天,

2. 交付标准:

①主要仪器、试剂和实验方法;

②包含protein ID、gene symbol、spectrum count、u-peptide、z-score、coverage等信息的蛋白鉴定列表;

③所有肽段信息表;

④质谱原始数据(raw data)。


生物质谱图片.png


需确认的信息

1. 样品:如果样品为蛋白质溶液,蛋白质总量≥300mg; 如果是组织样品,样品总量≥0.1g; 如果是细胞样品,细胞数量≥107个;如果是体液样品,血清≥200ml,脑脊液≥200ml,尿液≥1ml,泪液≥1ml;

2. 样品采集过程中使用到塑料制品时,尽量使用无色进口产品,以减少塑料制品中杂质对质谱检测的影响;

3. 确认样品所属种属、分析需求。


文献参考 

[1]Liu Q, et al. In-depth proteomic characterization of endogenous nuclear receptors in mouse liver. Mol Cell Proteomics. 2013;12(2):473-84.

[2]Ruprecht B, et al. MALDI-TOF and nESI Orbitrap MS/MS identify orthogonal parts of the phosphoproteome. Proteomics. 2016;16(10):1447-56.

[3]Kobayashi D, et al. Identification of a specific translational machinery via TCTP-EF1A2 interaction regulating NF1-associated tumor growth by affinity purification and data-independent mass spectrometry acquisition (AP-DIA/SWATH). Mol Cell Proteomics. 2018 Oct 31. PubMed PMID: 30381327.


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