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石蜡/冰冻切片TUNEL凋亡

TUNEL凋亡显色法

TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理是当细胞发生凋亡时,DNA内切酶被激活,核小体间的基因组DNA被切断,暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上带有生物素(Biotin)标记的dUTP即Biotin-dUTP,随后于辣根过氧化物酶(HRP)标记的streptavidin结合,在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜检测到细胞凋亡。



实验意义

1. TUNEL法是一种分子生物学与形态学相结合的研究方法,可对完整的单个凋亡细胞或者凋亡小体进行原位染色,可以准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

2. 可用于石蜡切片、冰冻切片、培养的细胞等进行细胞凋亡检测,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学方法要高。

3. 操作简便快捷,在细胞凋亡的研究中被广泛采用。


实验步

1.石蜡切片TUNEL显色法:


①石蜡切片常规脱蜡至水,脱蜡剂二甲苯,至水剂乙醇;

②PBS漂洗3×5 min;

③加入蛋白酶K工作液37℃反应15-30 min, PBS漂洗3×5 min;

④4%多聚甲醛(pH7.4的PBS)室温固定15-30 min,PBS漂洗3×5 min;

⑤浸入封闭液(3%H2O2)室温封闭10 min,PBS漂洗3×5 min;

⑥加入适量TdT酶反应液,暗湿盒中37℃反应1 h,用SSC室温15 min终止反应后,PBS漂洗3×5 min;

⑦浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性,室温孵育3-5 min,PBS漂洗3×5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,37℃反应30-60 min,PBS漂洗3×5 min;

⑨滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次;

⑩选择是否用DAPI复染细胞核;

?脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。

 

2.冰冻切片TUNEL显色法:


①新鲜组织经处理后,立即在恒冷冰冻切片机内切片,厚度为5~6 μm;

②防脱玻片,贴片,室温阴干约12 h;

③4%多聚甲醛(pH7.4的PBS)室温固定10 min,PBS漂洗3×5 min;

④浸入封闭液(3%H2O2)室温封闭10 min,PBS漂洗3×5 min;

⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中),室温通透30 S-2 min;

⑥加入适量TdT酶反应液,暗湿盒中37℃反应1 h,用SSC室温15 min终止反应后,PBS漂洗3×5 min;

⑦浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性,室温孵育3-5 min,PBS漂洗3×5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,37℃反应30-60 min,PBS漂洗3×5 min;

⑨滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次;

⑩选择是否用DAPI复染细胞核;

?脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。


结果展示



 TUNEL2.png


实验完成周期及交付标准

1. 实验周期:1-2周

2. 交付标准:蜡块、切片、染色图片、实验报告(实验步骤、试剂、耗材等)


需确认的信息

1. 样本的种属

2. 样本的类型(固定的组织or蜡块or切片)

3. 是否提供试剂盒

4. 拍照要求

 

参考文献

[1] Bing L , Ying-Jie X , Xian-Ming C , et al. Molecular mechanism of inhibitory effects of CD59 gene on atherosclerosis in ApoE (-/-) mice[J]. Immunology Letters, 2013, 156(1-2):68-81.

[2] Ozimati A A . Immunodetection of Smad-4 in developing molar roots of alendronate-treated rats[J]. Archives of Oral Biology, 2013, 58(11):1744-1750.



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