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实例解读文献,一文带你GET国自然热点:lncRNA

时间:2019-01-08 阅读:1867

lncRNA在近几年科研领域中持续高热不减,研究表明lncRNA可通过影响染色质结构和转录因子占位、表观遗传学、以序列和结构特异性结合生物大分子等机制调节基因表达,在发育、机体内平衡和维持细胞命运中发挥重要作用, lncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种疾病密切相关。

随着高通量测序、lncRNA芯片等技术的发展,越来越多的lncRNA被鉴定出来,但具体的作用与功能仍然不是很清楚,因此lncRNA的研究领域依然是一片非常广阔的神秘区,具有极大的研究价值。相关研究往往更受基金资助的青睐,2018年国自然资助lncRNA研究相关项目就高达717项。


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lncRNA抑制基因转录作用机制




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lncRNA激活基因转录作用机制





lncRNA研究的主要步骤




1LncRNA的筛选

常用的方法包括RNA-seq、lncRNA array等。通过这些高通量方法,研究人员可快速获得与特定生物学过程或者疾病相关的lncRNA。



2LncRNA的验证

筛选到lncRNA后,可通过NONCODE或者lncRNAdb等网站进一步了解lncRNA的相关信息。

在实验方面,可通过定量PCR或者Northern Blot验证lncRNA的表达;通过RACE技术获得lncRNA全长序列。对于lncRNA定位信息,可通过查询RNAlocate数据库或者相关分子实验确定。



3LncRNA的功能研究

最基本的研究就是构建lncRNA表达载体或通过siRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA,直观地展现lncRNA的生物学功能。

在分子机制方面,常常通过lncRNA与RNA、lncRNA与蛋白、lncRNA与DNA等的相互作用分析来挖掘。





相关文献解读



下面,小编为大家解读一篇2018年10月发表在Nature immunology(IF 21.5060)上的文章,希望能给您的lncRNA研究提供一点思路和研究方法上的参考。


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“活化诱导的T淋巴细胞死亡(activation-induced cell death, AICD)可以被癌症利用来逃避免疫破坏。


这篇文章的研究证明了肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和1型辅助性T细胞(TH1),而不是2型辅助性T细胞和调节性T细胞,在乳腺癌和肺癌微环境中对AICD敏感。

T细胞对AICD的敏感性通过lncRNA-- NKILA抑制NF-κB活性进行调节。机制上,T细胞活化过程中,钙流入(calcium influx)通过TCR激活钙调素(Calmodulin),后者使NKILA启动子中的乙酰化酶解离,进而导致STAT1激活NKILA转录。

用NKILA基因敲除的CTLs处理小鼠能通过增加CTL浸润有效抑制乳腺癌患者来源的异种移植物生长。临床上,NKILA在肿瘤特异性CTLs和TH1细胞中的过度表达与这些细胞的凋亡和患者更短的生存时间相关。

研究结果突显了lncRNA在决定肿瘤介导的T细胞AICD中的重要性,并提示通过基因操作过继转移T细胞中的lncRNA可能提供一种新的抗肿瘤免疫疗法。



浅析文章思路


发现疾病表型:研究人员对乳腺癌病人CTL进行分析,发现肿瘤浸润T细胞亚群对AICD有明显的敏感性。

 

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a机制研究方面

首先,关联信号通路: 通过转录组谱和基因富集分析(GSEA)发现:NF-κB失活使活化型T细胞对AICD敏感(哈哈,又是NF-κB)。


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然后,筛选lncRNA:关联的分子/信号通路通过什么途径起作用呢?

我们的lncRNA华丽丽的登场了:通过免疫沉淀(Iκ B和p65)和lncRNA芯片分析(RIP–chip),筛选到XLOC_011899, RP11-854K16.3, RP11-315I20.3, NKILA共4个在活化T细胞中高表达的lncRNA,经过qPCR验证,shRNA沉默T细胞凋亡分析,最后确定NKILA。


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接下来验证lncRNA: 先体外细胞验证:通过shRNA敲低和过表达,研究NKILA对T细胞AICD和NF-κB信号通路的影响。结果显示 NKILA通过抑制NF-κB引起肿瘤特异性T细胞发生AICD。


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b动物体内验证

采用乳腺癌PDX小鼠模型,进一步证明NKILA在肿瘤特异性T细胞AICD中的作用,发现沉默NKILA可通过抑制AICD改善过继性T细胞治疗。


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到这里,故事好像已经挺清楚了,但是往往高水平研究高就高在不会止步于此......



临床关联研究


研究人员在乳腺癌和非小细胞肺癌临床肿瘤样本和外周血中进一步研究NKILA的表达,发现肿瘤特异性CTLs和TH1细胞过表达NKILA,并且过表达NKILA的肿瘤特异性CTLs和TH1细胞对AICD敏感。厉害之处是他们分析了大量乳腺癌和肺癌病人样本,对表达NKILA的CTLs(NKILAhiCTLs)含量与病人的生存期进行了关联分析,发现NKILAhiCTLs多,病人预后差。


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知其然,还要知其所以然。T细胞中NKILA是怎么被调节的呢?研究人员进一步研究了T细胞中NKILA的转录机制,通过GSEA分析发现JAK-STAT调节NKILA的表达,并通过报告基因系统找到了STAT1结合的NKILA启动子区。


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最后,研究人员对NKILA启动子区表观遗传调控进行了深入的研究,发现T细胞活化过程中,TCR信号触发钙流入诱导钙调素细胞核移位和活化,活化的钙调素将结合在NKILA启动子区域的HDACs移除并打开染色质,便于STAT1结合并激活NKILA的转录。


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文献就为大家解读到这里,感兴趣的朋友建议查阅原文献。




参考文献



1) Huang D, et al. NKILA lncRNA promotes tumor immune evasion by sensitizing T cells to activation-induced cell death. Nat Immunol. 2018;19(10):1112-1125.

2) Kaikkonen MU, Adelman K. Emerging Roles of Non-Coding RNA Transcription. Trends Biochem Sci. 2018 Sep;43(9):654-667.